IL-6与BMP-7共同作用人髓核细胞对Ⅱ型胶原与TIMP-1基因的调控关系

摘要

背景：颈肩痛、腰腿痛主要是由于椎间盘退变引起来的，给患者及其家属带来沉重负担。自1934年Mixter和Barr[1]首次采用手术治疗腰椎间盘突出所致的坐骨神经痛后，至此手术治疗椎间盘突出引起的症状已成为主要治疗方式之一；但手术治疗的远期疗效并不确切。随着时代进步和科学技术发展，人们已经对退变椎间盘进行了深入的研究，目前比较一致的看法是：由于髓核合成代谢和分解代谢的不平衡，改变了椎间盘的生物化学特性，诱发了其病理生理学变化，从而使退变椎间盘中蛋白多糖含量和Ⅱ型胶原含量的减少，椎间盘正常的高度不能维持[2]，进而引起脊神经卡压和刺激，出现下腰痛和腰腿痛等症状。虽然已经明确了退变椎间盘的形态学和生化改变，但对多种发病因素之间的复杂相互关系仍不完全清楚，需要继续深入地研究和探索。
　　 目的：通过对人正常椎间盘髓核细胞的培养，观察髓核细胞在体外培养条件下细胞形态学变化及Ⅱ型胶原变化。探讨不同浓度BMP-7与IL-6作用于体外培养的人髓核细胞对Ⅱ型胶原与TIMP-1基因表达的影响。从基因水平观察细胞因子在椎间盘退变过程中的相互影响，为基因治疗椎间盘退变和组织工程学研究提供依据。
　　 方法：1、分离并消化人椎间盘髓核得到单个细胞并且完成原代细胞接种培养。2、在原代细胞融合传至第三代后建立对照组与实验组[施加IL-6(100ng/mL)；IL-6(100ng/mL)+BMP-7(100ng/mL)；IL-6(100ng/mL)+BMP-7(1000ng/mL)；BMP-7(1000ng/mL)因子刺激生长]。3、采用HE染色法定时于倒置显微镜下观察细胞形态的变化，免疫细胞化学染色法检测Ⅱ型胶原的表达情况。4、应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测不同浓度BMP-7与IL-6作用下体外培养的人髓核细胞中TIMP-1和Ⅱ型胶原基因的表达量。5、经spss13.0统计软件分析得出结论。
　　 结果：1、在倒置相差显微镜下持续观察，10天后90％以上的细胞贴壁，原代细胞多为梭形，有伪足伸出；经胰酶消化传代后，细胞贴壁生长速度加快；但第四代开始细胞贴壁及生长缓慢。2、HE染色细胞多为梭形，有伪足伸出，细胞核为圆形或椭圆形，围绕细胞核，胞浆内可见较多空泡。Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色呈现阳性结果。3、应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测，Ⅱ型胶原及TIMP-1条带灰度值经方差分析，Ⅱ型胶原：F值为148.058，P=0.000；TIMP-1：F值为69.995，P=0.000，表明五组之间比较差异具有显著性。经LSD-t检验，结果显示IL-6组与1、3、4、5组相比有显著差异，P＜0.05；1、3组分别与4、5组相比有显著差异，P＜0.05；1组与3组相比差异不大，P＞50.05；4组与5组相比差异不大，P＞0.05。
　　 结论：本实验为椎间盘髓核细胞的培养提供了简单、有效的方法；随着细胞多次传代，髓核细胞逐渐退变；BMP-7可以对抗IL-6作用和正向调节椎间盘细胞Ⅱ型胶原基因及TIMP-1基因表达，提示BMP-7在临床治疗中可能具有逆转椎间盘退变的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文名称缩略词

声明

前言

第一部分 实验材料与试剂的制备

1实验材料

2主要试剂

第二部分 实验方法

1实验路线

2实验方法

3观察内容

第三部分 实验结果

第四部分 讨论

第五部分 结论

参考文献

附录

综述：椎间盘髓核细胞的培养及细胞因子对其影响

作者简介

致谢