马钱子碱通过JAK--STAT信号通路对多发性骨髓瘤U266细胞粘附分子的影响

摘要

目的： 多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种好发于中老年的浆细胞恶性增殖性疾病，其病因及发病机制尚未完全明确，现多认为与染色体的异常和前身细胞中某些癌基因激活、骨髓微环境中细胞因子的异常改变及基质细胞与瘤细胞粘附分子的异常表达有关，MM细胞表面的各种粘附分子，与骨髓基质细胞及ECM成份中的相应配体相结合，构成了瘤细胞锚定依赖性生长(anchorag e-dependentgrowth)的分子基础，骨髓基质细胞和ECM构成的网络为瘤细胞的生长提供了适宜的微环境。 近几年来，关于多发性骨髓瘤细胞因子的研究报道较多，有的已在临床应用。但有关多发性骨髓瘤粘附分子的研究，尤其在临床方面的探讨国内外报道的较少，且未达成共识。细胞粘附分子作为一种介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白，在细胞的发育、分化、正常组织结构的维持、炎症反应、肿瘤的发生发展等许多生理与病理过程中起重要作用，粘附作用几乎涵盖了机体所有的生理与病理过程。多发性骨髓瘤骨髓细胞表达一系列粘附分子，使骨髓瘤细胞选择性的粘附并归巢基质，为瘤细胞的增殖提供物理学及细胞因子的支持。故抑制细胞粘附分子的表达便显得很重要。 MM细胞表面CD44、CD54等粘附分子的高表达与MM发病及复发相关，国外已经研究运用一系列抗粘附分子单克隆抗体来治疗MM。 中草药对肿瘤细胞信号转导的作用受到人们的重视，且有越来越多的人在研究。其中马钱子为“以毒攻毒”药物之中的代表，也日益受到关注，并且用于多种肿瘤的临床治疗。马钱子又名苦实、番木鳖、马前子，始载于《本草纲木》，辛温大毒、散结消肿、通络止痛之功效，还有镇痛作用，用于治疗各种炎症和痹症。马钱子主要成分是士的宁(Strychnine)、马钱子碱(Brucine)等吲哚型生物碱。 JAKs(Janu s k inases)是一类酪氨酸蛋白激酶，细胞因子与受体结合后激活JA K，进而激活信号转录子和转录激活子(signal transducer and act ivato roftran scription，STAT);应激反应也能激活JAK-STAT信号转导，再诱导目的基因表达。JAK-STAT通路异常与多种恶性肿瘤的发生发展有密切联系。 AG490是JAK-STA T途径特异性信号转导阻滞剂，人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，分子式C17H14N2O3,相对分子质量为29413，结构类似酪氨酸。其作用机理是与酪氨酸激酶竞争结合位点，抑制JAK与底物STAT磷酸化，从而阻断JAK-STAT途径的传导。 方法： 1.细胞培养:使用含10％的胎牛血清的RPMI-1640培养液培养人多发性骨髓瘤细胞株U266，于37℃含有5％CO2的培养箱中培养，2-3天传代一次，收集对数生长期的细胞用于实验。 2.MTT法:取含有5×104U266细胞液接种至96孔培养板，加入不同浓度马钱子碱，使其终浓度为0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL;设空白孔和对照孔每种浓度均作3个平行孔，混匀后放入CO2孵箱中培养。分别于培养24、48、72h各取出1板，进行MTT实验。根据公式计算增殖抑制率。实验重复3次。 增殖抑制率=（对照孔A值-用药孔A值）/对照孔A值×100％lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)（Xm: lg最大剂量I:lg（最大剂量/相临剂量）P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率） 3.流式细胞术:取对照组及实验组对数生长期细胞，将细胞悬液移入50ml的离心管中，1000rpm离心5分钟，去上清，再用生理盐水洗一次，1000rpm离心5分钟，去上清，计数细胞，CD44、CD54分别设空白对照组、马钱子碱组、AG490组三组，于CD44三组内加入PE荧光标记的单抗，于CD54三组内加入FITC荧光标记的单抗，每1×106/ml细胞中均加20μ l，室温避光孵育半小时，流式细胞仪检测。 4.RT-PCR法:检测中stat3、stat5 mRNA的表达:将1×106/ml细胞接种于培养瓶，24h后，弃除培养液，分别加入含0.16 mg/ml马钱子碱、50μ mol/LA G490、50μ mol/L AG490+0.16 mg/ml马钱子碱的培养液，以不加药细胞作为对照。作用24h，48h后收集细胞，分别用于实验。后提取细胞RNA。再进行逆转录，然后发生PCR反应。stat3上游引物:，5' ctggcctttggtgttgaaat3'，下游引物:5' aaggcacccacagaaac-acaac3'，扩增目的片段长为202bp，退火温度为50.6℃。stat5上游引物:5' gtcacgcaggacacagagaa3'，下游引物:5' cctccagagacacctgcttc3'，扩增的目的片段长度为178bp，退火温度56.6℃。β-actin上游引物:5' TCCACCGCAAATG-CTTCTAG3'，下游引物:5' TGCTGTCACCTTCACCGTTC3'，扩增的目的片段长度为189 bp，退火温度50.4℃。吸光度值进行分析，以目标基因与β-actin扩增产物的吸光度值的比值表示表达水平。 5.统计方法:多发性骨髓瘤U266细胞增殖抑制率、多发性骨髓瘤U266细胞stat3、stat5mRNA表达量采用(X)±S表示。采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD法。 结果： 通过上述研究，我们发现: 1.马钱子碱对多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制率呈剂量和时间依赖性。取不同浓度马钱子碱作用于多发性骨髓瘤U266细胞测得0.05mg/mL马钱子碱24、48、72h抑制率为分别为0.8213±0.1742，0.5883±0.1977，0.7463±0.2112;0.10mg/mL马钱子碱24、48、72h增殖抑制率为分别为0.8872±0.1747，0.9670±0.1475，0.9887±0.1354;0.20 mg/mL马钱子碱24、48、72增殖抑制率为分别为1.1227±1.0324，1.3474±1.1792，1.4575±1.1845;0.40mg/mL马钱子碱24、48、72增殖抑制率为分别为1.2117±1.1296，1.3552±1.1001，1.7432±1.2132，采用(X)±S表示，有统计学意义(P＜0.05)。 2.马钱子碱及AG490均可下调多发性骨髓瘤细胞U266粘附分子CD44、CD54的表达。实验分为三组，空白对照组，加入马钱子碱组，加入AG490组，CD54各组测定的数值阳性率与平均荧光强度分别为:0.9143±0.0122，0.4435±0.0786;0.8893±0.0215，0.3200±0.0065;0.4228±0.0352，0.1944±0.0045。采用(X)±S表示，有统计学意义(P＜0.05)。 3.马钱子碱、AG490均可下调stat3、stat5mRNA表达水平(P＜0.05)而马钱子碱作用强于AG490组，并呈时间依赖性。马钱子碱+AG490组作用强于马钱子碱，AG490单独作用组，呈时间依赖性。在空白对照组、AG490组(50μmol/L)、马钱子碱组24（0.16mg/mL）、马钱子碱加AG49024（50μmol/L+0.16mg/mL），四组测得STAT3RNA的表达量分别为:0.6237±0.0292，0.5804±0.0135，0.4046±0.0067，0.1235±0.0023，STAT5RNA的表达量分别为:0.6206±0.0246，0.5920±0.0058，0.4086±0.0034，0.1254±0.0022，采用X±S表示，有统计学意义(P＜0.05)。马钱子碱组（0.16mg/mL）、马钱子碱加AG49024（50μmol/L+0.16mg/mL）24、48比较，24小时两组分别为:0.4046±0.0067，0.1235±0.0023;48小时两组分别为:0.2186±0.0175，0.0023±0.01358，采用(X)±S表示，有统计学意义(P＜0.05)。 结论： 1.马钱子碱对多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制率呈剂量和时间依赖性。 2.马钱子碱使多发性骨髓瘤U266细胞表面粘附分子CD44、CD54的表达下降，与JAK-STAT途径介导的信号传导通路相关。 3.马钱子碱与JAK-STAT特异性抑制剂AG490在下调STAT3、STAT5mRNA表达过程中有协同作用且有时间依赖性。

目录

声明

摘要

前言

1 材料及方法

1．1 材料

1．1．1 主要试剂

1．2 方法

1．2．1 MTT法

1．2．2 流式细胞术

1．2．3 RT-PCR法

1．2．4 统计方法

2 结果

3 讨论

4．结论

参考文献

综述 多发性骨髓瘤粘附分子及JAK-STAT信号传导通路的相关性研究

作者简历

致谢