PKA介导的Aβ25-35对钾通道(IA)的抑制及Humanin的拮抗作用

摘要

目的：阿尔茨海默病(Alzheimer‘s disease，AD)，又称老年痴呆，是以记忆、认知功能受损为主要特征的神经退行性疾病，其典型的病理学改变为老年斑(senile plaque,SP)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFT)和大量的神经元丧失。Β-淀粉样蛋白(β-amyloid beta protein，Aβ)是老年斑的主要成分，由39～43个氨基酸组成。研究发现Aβ25-35，一个短的分子片段具有与Aβ完整肽链相同的神经毒作用,因此被广泛应用于AD的实验研究。有关AD 病因和发病机制的学说很多，目前尚无定论，但普遍认为Aβ在AD发病过程中发挥着重要作用。因此深入研究其毒性作用机制，对理解AD的病理机制及防治具有重要作用。
　　 研究证实,电压依赖性钾通道广泛分布于中枢神经系统，主要通过影响动作电位的形成、动作电位的形状，调节动作电位的频率，调整静息膜电位等影响神经功能活动包括学习和记忆等。在海马神经元上至少存在两种电压门控性钾通道，即快速激活并快速失活的瞬时外向钾电流（IA）和缓慢激活且几乎不失活的延迟整流钾电流(IK)。研究表明钾通道参与与老化有关的认知功能的损伤,在学习和记忆过程中起重要作用。而IA 电流是动作电位复极化早期外向电流的主要成分，在调节神经元放电频率，动作电位的产生以及放电模式等方面具有重要作用。大量实验证明, IA的动力学特征受磷酸化调节，激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)可使海马锥体细胞IA通道的开放概率明显降低，从而导致动作电位的延长,引起Ca2+的大量内流,同时触发一些神经递质的释放。有研究证实cAMP/PKA-CREB通路在记忆形成中起着重要的作用。在AD中存在PKA-CREB信号通路功能障碍。研究显示，Aβ在低浓度即可引起PKA-CREB信号通路功能异常,引起与学习记忆功能密切相关的海马CA1区长时程增强(long-term potentiation, LTP)被抑制。本实验室前期研究已观察到Aβ可以显著抑制电压门控性钾通道（包括IA和IK)，由此我们推测Aβ25-35对IA 电流的抑制可能与PKA 途径的活化有关，或PKA 可能介导了Aβ25-35对IA 电流的抑制作用。
　　 Humanin (HN)是一种新近发现的神经保护肽，研究显示，HN能特异性的抑制家族性阿尔茨海默病（familiAlAlzheimer‘s disease，FAD)基因突变及Aβ沉积等诱发的神经元死亡。并且可通过拮抗Aβ25-35 诱导的PKC 活化从而拮抗Aβ25-35 诱导的对IK 电流的抑制。HN是否也能通过拮抗Aβ25-35 诱导的PKA 活化从而拮抗Aβ25-35 诱导的对IA 电流的抑制呢?基于上述推测，我们采用全细胞膜片钳技术观察PKA在Aβ引起钾通道功能改变过程中的作用和HN的拮抗作用。以阐明Aβ引起钾通道功能异常的机制及HN的保护作用。
　　 方法：
　　 1、海马神经元的分离提取选用7-10天的SD大鼠海马神经元，分离出CA1区制成细胞悬液，加到培养皿上。待细胞贴壁后，加入2ml 洁净细胞外液倒置显微镜下进行膜片钳记录。
　　 2、实验分组对照组、Aβ组（5 μmol/L）、HN组（5 μmol/L）、8-brom-camp组（5 μmol/L、50μmol/L、500μmol/L）、H-89（10μmol/L）+Aβ组（5 μmol/L）
　　 3、电生理测量全细胞膜片钳模式采用电压钳记录模式，在记录条件下给予细胞由-40～+70mV（阶跃10mV）的去极化脉冲，分别记录电压依赖总的钾电流和IK 电流，再经公式换算得出IA。IK 取其158ms 处的稳态电流，而IA 取其峰值电流进行分析。在同一海马神经元上，比较不同的给药方式引起的钾电流的变化。
　　 4、数据分析测定结果数据均以s x ?表示，运用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，加药前后的差异显著性用t 检验进行分析。检验水准α=0.05，P<0.05表示有显著性差异。
　　 结果：
　　 1、Aβ25-35 (5 μmol/L) 使电压依赖性的全钾电流和IA 电流都受到明显抑制。+70mV 去极化脉冲下, Aβ25-35 单独作用使全钾电流幅度从对照组的3421.70±409.98pA降低为2022.60±442.68pA，与对照组相比电流幅度降低59.11±12.94％（n=5，p<0.05）；IA 电流从对照组的2196.77±170.56pA降低为1340.61±259.71pA,与对照组相比电流幅度降低61.03±11.82％（n=5，p<0.05）。
　　 2、PKA 拮抗剂H-89（10μmol/L）能够阻断Aβ引起的对IA的抑制。联合使用H-89和Aβ时，取消了Aβ对钾电流的抑制，全钾电流和IA 电流基本恢复至对照组水平，相对于正常电流幅度分别为104.78±10.19％（n=5）和119.68±22.87％（n=5）；而同单独应用Aβ25-35(5 μmol/L)时两种电流的相对值均有统计学差异（p<0.05)；
　　 3、不同浓度的PKA 激动剂8-brom-camp(5 μmol/L、50μmol/L、500μmol/L）能够剂量依赖性抑制瞬时外向钾电流（IA），相对于对照组电流，IA的电流幅度分别降低87.18±15.33％（n=5, p>0.05）, 59.91±5.11％ (n=5, p<0.05), 46.59±2.56％ (n=5, p<0.05)。
　　 而延迟整流钾电流（IK）则略有上升，但无统计学差异；
　　 4、HN (5 μmol/L) 拮抗Aβ引起的对全钾电流和IA 电流的抑制；同时HN 也可拮抗PKA激动剂8-brom-camp (50μmol/L)引起的对IA 电流的抑制。在Aβ之后给予HN(5 μmol/L) 全钾电流和IA 电流幅度分别从2022.60±442.68pA和1340.61±259.71pA 升高为2952.00±272.01pA和1928.63±172.68pA（n=5，p<0.05），分别是对照组的86.27±7.95％和87.79±7.86％。与Aβ25-35组相比，均有统计学差异。而在8-brom-camp 之后给予HN （5μmol/L)，IA 相对电流幅度从59.91±5.11％升高为对照组的78.68±10.00％（n=5）。
　　 结论：
　　 1、急性给予Aβ25-35 抑制了电压依赖性的全钾电流、IA 电流。
　　 2、PKA 介导了Aβ对IA的抑制作用，通过活化PKA 途径实现对IA的抑制可能是Aβ毒性作用的机制之一。
　　 3、HN 拮抗了Aβ25-35对IA的抑制作用，与此同时HN 拮抗了PKA 激动剂引起的对IA的抑制。抑制Aβ对PKA的活化及由此引起的毒性作用可能是HN 拮抗Aβ毒性作用的机制之一。

目录

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材料与方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

译述 电压门控钾离子通道的构象和组织域

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