胺甲斑蝥素与氟桂利嗪合理配伍对耐药癫痫大鼠脑内P-gp表达的影响

摘要

目的 研究胺甲斑蝥素(4-Amino-2-Methyl-Cantharidinimide,AMC)与氟桂利嗪(Flunarizine,FLU)单用和不同配伍配方的最佳配伍剂量比例。观察两药单用和配伍组方对青霉素慢性点燃耐丙戊酸钠大鼠惊厥模型的对抗作用及对耐药大鼠脑内P-糖蛋白表达的影响,从蛋白水平探讨其抗耐药的作用机制。
　　 方法 (1)采用最大电休克惊厥模型,测定灌胃(ig)小鼠AMC与FLU单药和不同比例配伍组方(联合Ⅰ,comb1,AMC:FLU=1:1；联合Ⅱ,comb2,AMC:FLU=1:4；联合Ⅲ,comb3,AMC:FLI=4:1)的抗惊率,按Bliss法计算抗小鼠抗MES的ED50；(2)采用转轮法,测定灌胃(ig)小鼠单药和不同比例配伍组方的中枢神经系统(CNS)毒性作用,按Bliss法计算TD50；(3)用等效线法分析配伍组方疗效协同、毒性拮抗的配伍方案；(4)采用青霉素(PNC,3×106 U·kg-1 ip)连续点燃13天的方法,建立大鼠惊厥模型。灌胃惊厥大鼠丙戊酸钠(VPA,250mg·kg-1·d)21天,建立耐药癫痫模型。根据Racine分级标准和惊厥发作潜伏期作为评定药效指标。采用免疫组化(SABC法)技术,检测耐药大鼠脑内P-糖蛋白的表达变化,统计分析AMC、FLU单药和不同组方对耐药大鼠脑内P—gp表达量的影响。
　　 结果 (1)AMC与FLU的不同比例配伍对MES模型均有对抗作用,量效呈正相关性,ED50由大到小依次为FLU(29mg·kg-1),联合Ⅱ组(26mg·kg-1),AMC(25mg·kg-1),联合Ⅲ组(25mg·kg-1),联合Ⅰ组(18mg·kg-1)；(2)AMC,FLU,联合Ⅰ组,联合Ⅱ组,联合Ⅲ组均有CNS毒性,其TD50值由大到小依次为:联合Ⅲ组(779mg·kg-1)、AMC(545mg·kg-1),FLU(479mg·kg-1),联合Ⅰ组(470mg·kg-1),联合Ⅱ组(452mg·kg-1)；(3)联合Ⅰ组ED50、TD50等效点分别在等效线的下方和等效线上；联合Ⅱ组ED50、TD50等效点分别在等效线的下方和等效线上；联合Ⅲ组的ED50等效点在等效线上,而TD50等效点远离等效线而处于其上方；(4)PNC点燃模型和耐丙戊酸钠大鼠模型制备:48只大鼠,除正常对照鼠6只外,其余42鼠经小剂量青霉素(PNC,3×106U·kg-1)筛选。出现Racine Ⅳ—Ⅴ级并连续出现6—8次以上发作,确定惊厥模型点燃成功；42只惊厥大鼠除6只作为惊厥模型对照组外,其余36只惊厥大鼠灌胃丙戊酸钠25mg·kg-1·d,每天给药1次,持续3周。最后一次给药24h后应用PNC(3×106U·kg-1)进行动物筛选,36只惊厥大鼠全部对丙戊酸钠产生耐药；(5)AMC、FLU及AMC与FLU组方的抗耐药作用:灌胃AMC,FLU,及3个配伍组方均可使大鼠惊厥潜伏期明显延长,给药前后组内比较均有统计学差异(P<0.05)。(6)免疫组化检测结果:模型对照组P-gp表达量虽然在数值上比正常对照组增高,但没有统计学差异(P>0.05)；耐丙戊酸钠惊厥模型组大鼠的P-gp表达量较惊厥模型组明显增高,有显著性统计学差异(P<0.01)；AMC,FLU及三个用药组的P-gp水平均较耐丙戊酸钠模型组降低,统计学上均有显著性差异(P<0.01)。其中联合Ⅲ组降低P-gp水平最明显,与联合Ⅰ、Ⅱ组比较均有显著性差异(P<0.01)。
　　 结论 (1)AMC和FLU不同比例配伍均能剂量依赖性对抗最大电休克惊厥发作。联合Ⅰ组的效价强度最大；联合Ⅲ组的TD50值最大,说明其毒性最小,而联合Ⅱ组的TD50值最小,说明其毒性最大；联合Ⅰ,Ⅱ组抗惊厥作用和毒性均协同,联合Ⅲ组抗惊厥作用相加,毒性拮抗,为最佳配伍方案；(2)小剂量青霉素腹腔注射13天,大鼠出现恒定的部分发作-继发全身性发作(Ⅳ～Ⅴ级),灌胃丙戊酸钠21天,惊厥大鼠对丙戊酸钠产生耐受,耐丙戊酸钠惊厥模型的造模成功率达100％；(3)AMC,FLU及3个配伍组灌胃给药,均能对抗耐丙戊酸钠惊厥大鼠惊厥发作,抗耐药机制与其协同减少耐药惊厥大鼠脑内P-gp表达有关。在三种配伍方案中,联合Ⅲ组(4:1组方)抑制P-gp表达作用最强。