立体诱导兔骨髓间充质干细胞成软骨分化及其SOX9与Ⅱ型胶原基因时空表达关系的研究

摘要

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞(BoneMarrow-derivedMesenchymalStemCells，BMSCs)。体外立体诱导骨髓间充质干细胞向成软骨方向分化，观察立体诱导过程中骨髓间充质干细胞中Sox9及Ⅱ型胶原mRNA的含量随时间的表达关系，对组织工程化软骨进行基因水平上的初步研究。
　　 方法：新西兰大白兔3只。股骨粗隆处备皮，用骨髓穿刺针抽取骨髓，采用全骨髓贴壁培养生长法培养骨髓间充质干细胞，使之得到分离纯化。传代至第3代备用。MTT法测细胞增值率，描绘增殖曲线，观察细胞生长状态。取3代细胞，调整细胞数量为1.5×106/离心管，150g离心后分为实验组（立体成软骨诱导培养组）与对照组（立体非成软骨诱导培养组）。实验组采用含有10ng/mlthTGF-β1的成软骨诱导液培养，对照组采用不含TGF-β1的诱导液进行培养。分别在第4天，8天，12天，16天提取总RNA，行RT-PCR，检测Sox9及Ⅱ型胶原mRNA表达。
　　 结果：全骨髓培养后骨髓间充质干细胞呈贴壁生长，随着换液骨髓中其他不贴壁生长的细胞逐渐被弃去，使得骨髓间充质干细胞得到进一步纯化。传代后细胞生长速度明显加快，并呈旋涡状生长。3代骨髓间充质干细胞生长良好，经历潜伏期、对数期、平台期。实验组细胞第2天形成小球，并逐渐长大。而对照组细胞无法形成小球，松散沉积于离心管底。RT-PCR检测实验组Sox9与Ⅱ型胶原表达含量均随时间逐渐升高，两者呈高度相关性。对照组Sox9表达随时间变化无明显统计学意义，Ⅱ型胶原表达未检出。
　　 结论：全骨髓贴壁生长法可使骨髓间充质干细胞得到分离纯化。含有TGF-β1的诱导培养液可使骨髓间充质干细胞立体诱导成软骨分化，而不含TGF-β1的诱导培养液无法诱导成软骨分化。成软骨分化中，Sox9与Ⅱ型胶原表达逐渐增高，且两者呈相关性。TGF-β1可以上调Sox9的表达量，由于Sox9是Ⅱ型胶原转录因子，表明在本实验中立体诱导过程是通过上调Sox9表达从而促使成软骨分化的。

目录

声明

英文缩略词表

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法：

结果

1．免骨髓问充质干细胞分离、体外扩增

2．兔骨髓间充质干细胞MTT增殖检测结果

3．兔骨髓间充质干细胞立体培养成软骨分化

4．Sox9及二型胶原表达含量

附图

讨论

结论

参考文献

综述

个人简历

致谢