中国莱姆病螺旋体MLVA分型方法的建立与研究

摘要

目的：
　　建立适合中国莱姆病螺旋体（又称伯氏疏螺旋体）的多位点可变数目串联重复序列分析（multi-locusvariablenumbertandemrepeatanalysis,MLVA）基因分型方法，对来自中国12个省45个地区的95株伯氏疏螺旋体进行MLVA分型鉴定和聚类分析，探讨中国伯氏疏螺旋体菌群特征，并为莱姆病的分子流行病学调查，疫情溯源及菌群进化分析提供实验基础和理论依据。
　　方法：
　　1.MLVA是一种以可变数目串联重复序列（variablenumbertandemrepeat,VNTR）为基本单位的，根据每个位点VNTR在不同菌株中的多态性即拷贝数的差异，形成VNTR分辨率，通过VNTR分辨率的可叠加性以获得对菌株的最佳分辨效果的基因分型方法。
　　2.使用TandemRepeatsFinder基因扫描软件扫描中国优势菌种Borreliagarinii的国际参考菌株PBi的904.246kb染色体基因和质粒（CP26和LP54）基因，分析基因结构特点，筛选多个潜在的VNTR位点。
　　3.利用PCR（PolymeraseChainReaction）技术检验潜在VNTR位点的普遍扩增性和特异性差异的分辨能力。
　　4.通过STR（ShortTandemRepeat）测序收集VNTR信息并建立菌株VNTR谱。
　　5.聚类分析，用BioNumerics5.1软件处理数据,用Categorical系数和UPGMA（UnweightedPair-GroupMethodwithArithmetic，非加权算术平均法）进行聚类分析，初步建立莱姆病螺旋体的MLVA分型方法，进而对95株中国菌株和6株国际参考株进行MLVA分型研究，并与多位点序列分析（multi-locussequenceanalysis,MLSA）的基因分型结果进行比较。
　　结果：
　　1.筛选出5个VNTR位点进行组合，建立莱姆病螺旋体的MLVA方法。将101株莱姆病螺旋体分为51个独立的基因型，4个明显的基因簇，即Borreliaburgdorferisensustricto,Borreliagarinii,Borreliaafzelii,Borreliavalaisiana。分型结果与MLSA基因分型结果一致。
　　2.全部5个VNTR位点（VNTR-1,VNTR-2,VNTR-3,VNTR-4,和VNTR-5）对应的等位基因种类数分别为7,3,9,7和6；相应的位点多态性指数为0.79,0.22,0.77,0.71和0.67；5个VNTR位点分辨率叠加，多态性指数达0.96。
　　结论：
　　1.建立了一种适合中国莱姆病螺旋体菌株的MLVA基因分型的方法。MLVA分型方法操作简单，分型稳定，重复性好，分型结果准确可靠。
　　2.聚类分型结果表明中国莱姆病螺旋体表现出广泛的遗传异质性，存在Borreliaburgdorferisensustricto,Borreliagarinii,Borreliaafzelii,Borreliavalaisiana四个基因型，并且在南北方分布存在明显差异。

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插图和附表清单

前 言

材料与方法

1.材料

2.方法

结 果

1．文献报道的位点

2．软件筛选的潜在VNTR位点结果

3．全部101株菌应用新MLVA分型结果

讨 论

1．基因分型方法的评估

2．101株菌聚类分析

3．中国基因种型的地理分布概况

4．基因种型与莱姆病的临床表现相关

结 论

参考文献

综 述

硕士在读期间发表文章

致谢

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