Mps1突变体在染色体不稳定性中的作用机制研究

摘要

研究背景：目前肿瘤的基因研究已取得了令人瞩目的进展，重要的癌基因激活是主要原因之一。RAS/RAF/ERK信号通路涉及了多个癌基因的激活，与恶性肿瘤的发生密切相关。科研人员已在人类许多肿瘤组织中都发现B-RAF基因的突变，如70％的皮肤癌，50%的甲状腺癌，20%的结肠癌等恶性肿瘤中都检测到B-RAF基因的突变。其中大约90%的点突变为T1796A，该点突变导致缬氨酸被谷氨酸所代替(V600E)，称B-RAFV600E。2008年，有研究首次报道了B-RAF基因在有丝分裂期的新作用，该基因突变后可导致人皮肤癌细胞、黑色素细胞和永生化上皮细胞出现纺锤体异常、染色体不稳定性及非整倍体细胞出现。在此基础上课题组前期又鉴定出癌基因B-RAFV600E新的作用底物—纺锤体检测点激酶Mps1，二者在有丝分裂期均定位于着丝粒和中心体处，B-RAFV600E主要通过增强Mps1的稳定性而使Mps1蛋白水平以及激酶活性显著增加，导致纺锤体检测点过度激活。进一步机制研究发现，癌基因B-RAFV600E通过磷酸化修饰纺锤体监测点激酶Mps1-S281、S436、S821,分别影响Mps1激酶的蛋白质稳定性、激酶活性等。前期研究发现pS281-Mps1通过抑制由APC/CCdc20介导的Mps1蛋白泛素-蛋白酶体降解途径而增强其蛋白稳定性，导致过量Mps1在中心体处聚积。那么B-RAFV600E磷酸化修饰Mps1导致Mps1突变体异常稳定，是否影响肿瘤细胞中心体复制、纺锤体检测点功能？这是一个值得探讨的问题。
　　研究目的：阐明Mps1突变体对中心体复制、纺锤体检测点功能的影响，结合前期研究阐述B-RAFV600E导致肿瘤细胞中心体复制、纺锤体检测点功能异常机制，最终明确癌基因B-RAFV600E在肿瘤细胞染色体不稳定性中的分子机制。
　　研究方法：为明确Mps1突变体对中心体复制、纺锤体检测点功能的影响，我们主要从以下几方面进行研究：
　　(1)采用HU-arrestassay将SK-MEL31细胞阻断于有丝分裂S期，免疫荧光技术分析Mps1突变体对中心体复制的影响。
　　(2)以MBP作为底物进行激酶活性检测，Mps1突变体对Mps1激酶活性的影响。
　　(3)Metaphase-spreadsanalysis分析Mps1突变体对染色体不稳定性的影响。
　　(4)购买皮肤癌组织芯片(ME207)，以p-ERK（反映B-RAFV600E激酶活性）、p-S281Mps1抗体做免疫组化分析B-RAFV600E信号通路与pS281-Mps1在皮肤癌组织芯片中的相关性。
　　研究结果：(1)采用HU-arrestassay将SK-MEL31细胞阻断于有丝分裂S期，免疫荧光技术分析表达WT-Mps1、S281E、S436E、S821E、EEE及AAA细胞中中心体数目的变化发现，与表达WT-Mps1、AAA的细胞相比表达S281E、S436E、EEE的细胞中心体复制异常（n≥3）细胞比例显著增高，依次为55%、30%、70%。
　　(2)以MBP作为底物，以kinase-dead（KD即不具有激酶活性）作为对照，进行激酶活性检测，WT-Mps1有效磷酸化修饰MBP，而Mps1-KD则失活。S281E和S821E与野生型相比同样具有激酶活性。然而，S281A和S821A的Mps1激酶活性减弱甚微，S436A却显著抑制了Mps1激酶活性，表明pS436-Mps1对Mps1激酶活性至关重要。S436E、EEE比WT-Mps1具有更高的激酶活性。
　　(3)以pBabe-puro-HA-Mps1-EEE逆转录病毒颗粒感染Sbcl2细胞和SK-MEL31细胞，感染效率达90%以上。96h后，进行metaphase-spreadsanalysis，结果表明，与空载体对照组相比，稳定表达Mps1-EEE的Sbcl2细胞，SK-MEL31细胞染色体分离异常细胞比例显著增高，其中，主要为多极纺锤体表型，其次亦有少数细胞出现lagging-chromosomes。免疫荧光结果显示稳定表达Mps1-EEE的Sbcl2细胞，SK-MEL31细胞中染色体数目大于或小于46的细胞比例显著增加，即非整倍体细胞。
　　(4)从USBiomax,Inc(Rockville,MD)购买皮肤癌组织芯片(ME207)，该芯片包括正常皮肤对照及皮肤癌不同分期组织。以p-ERK（反映B-RAFV600E激酶活性）、p-S281Mps1抗体做免疫组化分析，结果发现p-MAPK阳性（包括阳性和强阳性）在正常皮肤组织（0%）、恶性黑色素瘤（48%）、转移黑色素瘤（69%）比例依次显著增高（P＜0.001）。同样pS281-Mps1阳性表达（包括阳性和强阳性）在正常皮肤组织（0%）、恶性黑色素瘤（54%）、转移黑色素瘤（91%）比例依次显著增高（P＜0.001）。并且我们发现显示p-MAPK阳性的病例同时显示pS281-Mps1阳性表达，反之亦然。提示二者在皮肤癌组织中显著相关，并与临床分期呈正相关（r＝0.25,P＝0.002,Spearmantest）。
　　结论：综合以上结果表明癌基因B-RAFV600E通过磷酸化修饰有丝纺锤体监测点激酶Mps1-S281、S436、S821,分别影响Mps1激酶的蛋白质稳定性、激酶活性等，进而导致中心体过度复制、多极纺锤体出现，在肿瘤细胞染色体不稳定性、非整倍体细胞形成中发挥重要作用。

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中英文对照表

中文摘要

英文摘要

第一章 前 言

1. B-RAFV600E在各种肿瘤中突变频率与临床分级、耐药性、预后关系

2. 针对B-RAFV600E的各种肿瘤治疗策略

3. B-RAFV600E在肿瘤发生发展中作用机制的研究

4. 本课题组前期对B-RAFV600E基因的研究突破

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3数据统计分析

第三章 实验结果

3.1 Mps1突变体对中心体复制及纺锤体形成的影响

3.2 Mps1突变体对Mps1蛋白激酶活性的影响

3.3 Mps1突变体对染色体分离的影响

3.4 B-RAFV600E/MAPK信号通路与pS281-Mps1在皮肤癌组织中的相关性分析

第四章 讨 论

第五章 结 论

参考文献

第六章 前期研究基础

6.1 Mps1基因对表达B-RAFV600E的细胞中心体复制及纺锤体结构的影响

6.2 Mps1蛋白上B-RAFV600E特异性磷酸化位点的鉴定

6.3 B-RAFV600E相应位点磷酸化对Mps1与Cdc27结合能力的影响

综 述

个人简历

攻读博士学位期间公开发表的论文：

致谢