Rb/E2F1调控B[a]P致神经元凋亡的机制研究

摘要

目的：通过体外实验研究Rb/E2F1信号通路在B[a]P致神经元凋亡中的作用。 方法： 1.建立体外染毒模型:选取新生1-3天的SD大鼠，用神经基础培养基（98％Neurobasal-A无血清培养基+2％ B27培养基添加剂+0.5mmol/L L-谷氨酰胺）培养皮质神经元，培养五天之后用于实验，以B[a]P同时加入S9混合液对细胞染毒，染毒终浓度分别为0.5μmol/L B[a]P，1μmol/L B[a]P，2μmol/L B[a]P，同时设立空白对照组、DMSO溶剂对照组、S9混合液对照组、抑制剂(Roscovitine Ros)对照组、2μmol/LB[a]P+Ros组，染毒五天后处理细胞。 2.CCK-8法检测细胞活力，Annexin-Ⅴ/PI双染法检测细胞的凋亡率。 3.Western-blot法检测皮质神经元Rb/E2F1通路上相关蛋白CDK5、Rb、p-Rb[Ser780]、p-Rb[Ser807/811]、E2F1、P53表达情况。 结果： 1.CCK-8法检测结果显示，各染毒组随B[a]P染毒剂量增高皮质神经元的活力逐渐下降，差异有统计学意义，与空白对照组相比较活力分别下降了14.84％，23.75％，44.48％。1μmol/LB[a]P、2μmol/LB[a]P染毒组与0.5μmol/L B[a]P染毒组活力相比较差异有统计学意义(P＜0.05)，2μmol/LB[a]P染毒组与1μmol/LB[a]P染毒组活力相比较差异有统计学意义(P＜0.05)，2μmol/LB[a]P+Ros组与2μmol/LB[a]P组相比较活力上升了0.26倍。 2.Annexin-Ⅴ/PI双染法检测结果显示，染毒浓度增高，神经元凋亡率随之增高。0.5μmol/LB[a]P、1μmol/LB[a]P、2μmol/L B[a]P染毒组神经元凋亡率与各对照组相比较有统计学差异，各组神经元凋亡率与空白对照组相比较分别增加了3.45倍、6.79倍、13.33倍。2μmol/L B[a]P+Ros组神经元凋亡率与2μmol/LB[a]P组相比较下降了42.66％。 3.免疫印迹对细胞周期相关蛋白的检测结果显示，随染毒剂量增高各蛋白表达呈上升趋势。1μmol/L B[a]P、2μmol/L B[a]P染毒组Rb蛋白的表达量与各对照组Rb蛋白的表达量相比较具有统计学意义，两组分别与空白对照组相比，Rb蛋白的表达量分别增加了0.67倍、1.83倍。2μmol/L B[a]P+Ros组Rb蛋白的表达量与2μmol/LB[a]P组相比较下降了34.03％。1μmol/L B[a]P、2μmol/L B[a]P染毒组Rb蛋白的Ser780位点磷酸化蛋白的表达量与各对照组、0.5μmol/L B[a]P组相比较差别有统计学意义，两组分别与空白对照组相比较Ser780位点磷酸化蛋白的表达量分别增加了0.51倍、0.62倍。2μmol/L B[a]P+Ros组Ser780位点磷酸化蛋白的表达量与2μmol/L B[a]P组相比较下降了16.85％。1μmol/L B[a]P、2μmol/L B[a]P染毒组Rb蛋白的Ser807/811位点磷酸化蛋白的表达量与各对照组相比较有统计学差异，两组分别与空白对照组相比较Ser807/811位点磷酸化蛋白的表达量分别增加了0.48倍、0.54倍。2μmol/L B[a]P+Ros组Ser807/811位点磷酸化蛋白的表达量与2μ mol/L B[a]P组相比较下降了3.61％。0.5μmol/L B[a]P、1μmol/L B[a]P、2μ mol/L B[a]P染毒组E2F1蛋白表达量与各对照组相比较有统计学差异，各组E2F1蛋白表达量分别与空白对照组相比较分别增加了0.49倍、0.62倍、0.98倍。2μmol/L B[a]P+Ros组E2F1蛋白表达量与2μmol/L B[a]P组相比较下降了23.21％。 4.免疫印迹法检测CDK5蛋白表达结果显示，1μmol/L B[a]P、2μmol/L B[a]P染毒组CDK5蛋白的表达量与各对照组相比较有统计学差异，两组CDK5蛋白的表达量与空白对照组相比较分别增加了0.58倍、1.19倍。 5.免疫印迹法检测P53蛋白表达结果显示，0.5μmol/L B[a]P、1μmol/L B[a]P、2μmol/LB[a]P染毒组P53蛋白表达量与各对照组相比较有统计学差异，各组P53蛋白表达量分别与空白对照组相比较分别增加了0.93倍、0.98倍、1.38倍。2μmol/LB[a]P+Ros组P53蛋白表达量与2μmol/L B[a]P组相比较下降了20％。 结论： 1.苯并[a]芘可降低皮质神经元的活力，诱导神经元周期重启从而导致皮质神经元凋亡。 2.苯并[a]芘可以通过CDK5重启周期，进而通过Rb/E2F1-P53通路诱导神经元凋亡。 3.CDK5的特异性抑制剂ROS对苯并[a]芘诱导的神经元凋亡有保护作用。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1 体外培养的SD大鼠皮质神经元及纯度鉴定结果

2 神经元活力测定

3 神经元凋亡率

4 CDK5在神经元暴露于B[a]P后被激活

5 B[a]P可致神经元周期重启

6 E2F1以依赖P53的方式调节B[a]P诱导的神经元凋亡

讨论

参考文献

结论

综述 神经细胞周期重启与凋亡

致谢

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