杜鹃素对氧化应激诱导血管内皮细胞损伤的保护作用及分子机制研究

摘要

目的:杜鹃素是存在于植物中的一种主要二氢黄酮化合物，是中药“满山红”（兴安杜鹃Rhododendron dauricum L.）的主要止咳祛痰活性物质，现代药理学研究表明杜鹃素还具有抗菌、抗炎、免疫抑制及血管平滑肌增值抑制作用。杜鹃素与存在于柑橘类水果中的橙皮素、柚皮素同属二氢黄酮化合物，且具有相似的化学结构特征，但是后者在抗氧化及细胞损伤保护方面研究较多，而杜鹃素抗氧化和细胞保护作用研究目前未见报道。本课题第一部分以具有血管内皮细胞特性的EA.hy926细胞株为研究对象研究杜鹃素对过氧化氢(H2O2)诱导EA.hy926细胞损伤及凋亡的抑制作用;第二部分主要研究杜鹃素对H2O2诱导的EA.hy926细胞MAPK信号传导通路的调节作用，以阐明其抑制凋亡的分子信号机制;第三部分初步研究杜鹃素对FeCl3诱导大鼠颈动脉血栓形成的抑制作用，以体内研究间接探讨其抑制血管内皮氧化损伤作用。本课题主要通过以上三部分研究来揭示杜鹃素抑制氧化应激诱导的血管内皮细胞损伤作用及其可能的分子机制。 方法: (1)采用MTT法测定H2O2对EA.hy926细胞活力影响及杜鹃素对H2O2诱导的EA.hy926细胞活力下降的抑制作用; (2)采用紫外分光光度法测定杜鹃素对H2O2诱导EA.hy926细胞内丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响; (3)采用流式细胞术测定杜鹃素对H2O2诱导EA.hy926细胞内活性氧(ROS)水平的影响; (4)采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测杜鹃素对H2O2诱导EA.hy926细胞凋亡率的影响; (5)采用RT-PCR检测杜鹃素对H2O2诱导EA.hy926细胞凋亡相关蛋白Bax mRNA、Bcl-2mRNA的表达影响; (6)通过Western blot检测杜鹃素对H2O2诱导EA.hy926细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3的表达影响; (7)通过Westernblot结合激光共聚焦检测杜鹃素对H2O2诱导EA.hy926细胞紧密连接蛋白occludin的表达影响; (8)采用Western blot检测杜鹃素对H2O2诱导EA.hy926细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的调控作用; (9)采用紫外分光光度法测定杜鹃素对FeCl3诱导的大鼠血清丙二醛(MDA)含量及超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响; (10)采用HE染色检测杜鹃素对FeCl3诱导的大鼠颈动脉内血栓形成的病理学变化影响。 结果: (1)杜鹃素在浓度小于60μmol/L时对EA.hy926细胞没有检测到细胞毒性作用; (2)杜鹃素在15、30和60μmol/L浓度时具有明显抑制H2O2诱导的EA.hy926细胞内SOD、GSH-Px活性和细胞活力的降低及MDA和ROS水平的升高(p＜0.05)，并呈明显剂量关系; (3)AnnexinⅤ-FITC/PI双染实验表明杜鹃素在0、15、30和60μmol/L浓度时对H2O2诱导的EA.hy926细胞凋亡率分别为39.1％、32.35、21.9和15.4％，表明杜鹃素对H2O2诱导的EA.hy926细胞凋亡具有显著抑制作用(p＜0.05); (4)Western blot和RT-PCR检测结果显示杜鹃素在15、30和60μmol/L浓度时具有显著抑制H2O2诱导EA.hy926细胞内促凋亡蛋白Bax和Bax mRNA表达的升高及抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-2mRNA表达的降低(p＜0.05)，且抑制作用呈明显剂量关系; (5)Western blot检测结果表明杜鹃素在15、30和60μmol/L浓度时具有显著抑制H2O2诱导EA.hy926细胞cleaved caspase-3表达的升高(p＜0.05)，且抑制作用呈明显剂量关系; (6)Western blot结合激光共聚焦检测结果表明杜鹃素在15、30和60μmol/L浓度时具有显著抑制H2O2诱导EA.hy926细胞紧密连接蛋白occludin表达的降低(p＜0.05)，且抑制作用呈明显剂量关系; (7)Western blot检测结果表明杜鹃素对H2O2诱导的蛋白激酶ERK1/2、p38MAPK、c-Src及蛋白磷酸酶SHP-2磷酸化水平具有明显抑制作用(p＜0.05)，且抑制作用呈明显剂量关系; (8)大鼠经灌胃给药杜鹃素20、40和80 mg/kg，连续14天，FeCl3诱导颈主动脉血栓实验结果表明，给药组血清中MDA水平明显低于FeCl3模型组，SOD和GSH-Px活性明显高于FeCl3模型组(p＜0.05)，并具有剂量依赖关系; (9)HE染色结果表明高剂量杜鹃素(80 mg/kg)具有明显抑制FeCl3诱导的大鼠颈动脉血管内斑块堵塞，表明杜鹃素具有抑制FeCl3诱导的血栓形成作用，初步推断可能与其抗氧化应激作用有关。 结论: (1)杜鹃素能够抑制H2O2诱导的EA.hy926细胞凋亡，其作用机制可能是调节细胞内抗氧化酶SOD和GSH-Px活性、调控Bcl-2家族中Bcl-2和Bax基因及蛋白表达以及调节ERK1/2和p38活性; (2)杜鹃素调控ERK1/2和p38活性与其调控上游c-Src及SHP-2信号有关; (3)初步体内实验表明杜鹃素具有抑制FeCl3诱导大鼠颈动脉血栓形成的作用; (4)初步研究表明杜鹃素具有抗氧化应激及预防细胞损伤作用。

目录

声明

摘要

前言

参考文献

第一章 杜鹃素抑制H2O2诱导EA．hy926细胞损伤的研究

一、杜鹃素对H2O2诱导EA．hy926细胞凋亡的抑制作用研究

1 实验材料及方法

2 实验结果

3 实验讨论

4 本节小结

二、杜鹃素对H2O2诱导EA．hy926细胞紧密连接破坏的抑制作用

1 实验材料及方法

2 实验结果

3．讨论

3．本节小结

参考文献

第二章 杜鹃素对H2O2诱导EA．hy926细胞MAPK信号传导通路的调控作用研究

1 实验材料及方法

2 实验结果

3 实验讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 杜鹃素抑制FeCl3诱导大鼠颈动脉血栓形成作用

1 实验材料及方法

2 实验结果

3 实验讨论

4 本章小结

参考文献

主要结论

英文缩略词表

综述 氧化应激诱导凋亡与MAPK信号传导通路

攻读学位期间发表论文情况

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