过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对大鼠足细胞Ⅳ型胶原表达的抑制及作用机制研究

摘要

第一部分大鼠肾脏足细胞的原代培养
　　目的：
　　通过原代培养，获得生物学特性更稳定和更接近于体内的足细胞，为后续实验提供基本保证。
　　方法：
　　用高压蒸汽灭菌的手术器械，从大鼠体内分离肾脏，剥离肾被膜、分离肾脏皮质，然后用剪刀剪碎，分别以大小不同的筛网筛离（75、18目筛网），以DMEM/F12培养基悬浮筛离的的肾小球，然后接种于培养瓶中（事先将Ⅰ型胶原包被在培养瓶内壁）。通过对大鼠肾脏足细胞特异标志蛋白进行免疫荧光染色（WT-1和Synaptopodin蛋白），对足细胞进行鉴定。
　　结果：
　　从大鼠肾脏分离肾小球后，培养第5天可见细胞克隆从肾小球周围爬出，这些细胞在形态学上表现出多边形等上皮细胞的形态，通过免疫荧光染色，WT-1和Synaptopodin蛋白均呈阳性。
　　结论：
　　以差异过滤法分离肾小球，以WT-1和Synaptopodin作为鉴定足细胞的特异标志蛋白，确认得到原代培养的的大鼠足细胞。
　　第二部分足细胞内PPARγ的表达与定位
　　目的：
　　研究足细胞内PPARγ的表达和定位。
　　方法：
　　分别以RT-PCR和Western blot方法，对大鼠足细胞PPARγ mRNA和蛋白水平进行检测，同时通过免疫组化染色观察PPARγ在足细胞中的定位。在此基础上，分别以罗格列酮10μM和吡格列酮1μM处理足细胞24小时，检测PPARγ在足细胞中的表达变化。为了进一步检测作为转录因子PPARγ的生物学活性，以包含PPRE的荧光素酶报告基因质粒PGL3-PPRE和对照质粒PRL-TK共同转染足细胞，检测PPRE的荧光素酶活性。
　　结果：
　　经RT-PCR检测，正常大鼠肾脏足细胞中表达PPARγ。以吡格列酮或罗格列酮分别处理足细胞，可见足细胞内PPARγ蛋白表达增加，与正常对照组相比，有统计学意义（P<0.05）。免疫组化染色显示PPARγ阳性染色位于细胞质、细胞核和足突。吡格列酮和罗格列酮处理的足细胞，其PPRE荧光素酶活性增强，与对照组相比，有显著差别（P<0.05）。
　　结论：
　　在大鼠肾脏足细胞有PPARγ表达；吡格列酮和罗格列酮诱导PPARγ在足细胞的表达，并增强其PPARγ转录活性。
　　第三部分 PPARγ激动剂在TGFβ诱导足细胞产生Ⅳ型胶原中的作用的实验研究
　　目的：
　　通过研究PPARγ激动剂对TGFβ诱导的足细胞Ⅳ型胶原的表达影响，探讨PPARγ激动剂在足细胞产生Ⅳ型胶原中的作用。
　　方法：
　　在TGFβ10ng/ml诱导24小时后，分别以罗格列酮10μM和吡格列酮1μM继续处理24小时，用ELISA方法检测各组足细胞培养上清Ⅳ型胶原蛋白的浓度，同时用免疫荧光染色的方法观察Ⅳ型胶原蛋白的荧光表达强度，之后以 Ad-PPARγ-EGFP病毒质粒转染足细胞或以GW9662处理各组足细胞24小时，收集标本检测Ⅳ型胶原蛋白在各组中的表达水平。
　　结果：
　　足细胞培养上清Ⅳ型胶原蛋白浓度，在TGFβ组增加明显，与Control组相比差异显著（P<0.01），而在TGFβ+Rosi组或TGFβ+Pio组则明显减少，与TGFβ组相比差异显著（P<0.05）。足细胞PPARγ蛋白的表达，与Control组相比，Pio组或Ad-PPARγ组增加，其中Ad-PPARγ组与Ad-vecto组相比增加6倍。Ⅳ型胶原的免疫荧光强度在TGFβ组明显增强，而TGFβ+Pio组与Control组相比无明显差别。足细胞内Ⅳ型胶原mRNA和蛋白水平在TGFβ组明显增加，与Control组相比差异显著（P<0.05），而TGFβ+Rosi组或TGFβ+Pio组则明显减少，与TGFβ组相比有统计学意义（P<0.05）。足细胞内Ⅳ型胶原蛋白表达，在TGFβ+Ad-PPARγ组减少2-3倍，与TGFβ组相比，差异显著（P<0.05），而TGFβ+GW9662组表达明显增加，且与Control组和TGFβ+Pio组相比，均有明显差异（P<0.05），TGFβ+Pio+GW9662组与 Control组相比无明显差别。
　　结论：
　　TGFβ诱导Ⅳ型胶原在足细胞中的表达；PPARγ激动剂或PPARγ在足细胞的过表达均可抑制Ⅳ型胶原蛋白的产生，而GW9662减弱了这种抑制作用。
　　第四部分 PPARγ激动剂抑制TGFβ诱导足细胞Ⅳ型胶原产生的机制研究
　　目的：
　　通过对TGFβ诱导下的P-Smad2/3蛋白表达和Ⅳ型胶原基因SBE荧光素酶活性变化的研究，探讨Pio对TGFβ/Smad通路的影响，以及PPARγ激动剂在TGFβ诱导足细胞产生Ⅳ型胶原的机制。
　　方法：
　　以TGFβ10ng/ml诱导足细胞，给予或不给予Pio处理，分别在0、15、30min时用Western blot方法检测足细胞内P-Smad2/3蛋白表达的变化。以promoter软件进行启动子分析，对Ⅳ型胶原基因上的SBE进行预测，然后分别在各处理组细胞对此SBE序列的荧光素酶活性进行检测。
　　结果：
　　TGFβ诱导足细胞内P-Smad2/3蛋白的表达增加，并随时间的延长而增加；在每一个时间点，TGFβ+Pio组细胞内P-Smad2/3蛋白表达均减少，与TGFβ组相比，有统计学差异（P<0.05）；TGFβ诱导下Ⅳ型胶原基因 SBE荧光素酶活性增加，而TGFβ+Pio组和TGFβ+Rosi组其活性明显下降，与TGFβ组相比有统计学意义（P值分别为P<0.01和P<0.05）。
　　结论：
　　TGFβ可诱导磷酸化Smad2/3的表达，并且是呈现时间依赖性；PPARγ激动剂抑制TGFβ所诱导的P-Smad2/3蛋白在足细胞中的表达；PPARγ激动剂使Ⅳ型胶原基因SBE荧光素酶的活性下降。

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前言

第一部分 大鼠肾脏足细胞的原代培养

1 材料与方法

2 结 果

3 分析与讨论

4 结 论

第二部分 足细胞内PPARγ的表达及定位

1 材料与方法

2 结 果

3 分析与讨论

4 结 论

第三部分 PPARγ激动剂在TGFβ诱导足细胞产生Ⅳ型胶原中的作用的实验研究

1 材料与方法

2 结 果

3 分析与讨论

4 结 论

第四部分 PPARγ激动剂抑制足细胞产生Ⅳ型胶原的机制研究

1 材料与方法

2 结 果

3 分析与讨论

4 结 论

展望

本课题研究提出的科学假设：

需要进一步验证和研究的问题与方法：

参考文献

综述:PPARγ激动剂在糖尿病肾病治疗中的进展

致谢

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果

个人简历