脂联素及其受体对血管内皮细胞一氧化氮合酶活性差异调节的分子机制研究

摘要

目的：
　　随着心血管疾病所导致的病死率不断增加，心血管系统疾病已经成为全球威胁人类健康的“全民公敌”。血管内皮具有内分泌和代谢功能，大量的研究证明，许多心血管疾病都有危险因子作用于血管内皮，进一步研究表明，内皮功能紊乱可由一氧化氮（NO）释放减少或破坏增多等其他原因造成，其原因可能是精氨酸（Arg）缺乏、一氧化氮合酶（NOS）生成或磷酸化异常。内皮的正常功能破坏，可使血管收缩舒张调节介质、凝血系统因子、促生长介质之间的功能紊乱，因此成为了心血管系统疾病一致的发生发展基础[1]。
　　脂联素（Adiponectin，APN）作为一种脂肪细胞因子，研究证明脂联素具有加速脂肪酸氧化,促进糖转运及降低肝糖输出，对抗血管内皮炎症反应，改善内皮依赖性血管舒张功能等作用[2]。此外,在冠心病及其他大血管病变中发现血浆脂联素水平明显降低,这提示脂联素与心血管病变密切相关。大量的动物实验证明，APN基因敲除（APN-/-）小鼠可导致严重的血管功能失调[3]，如对乙酰胆碱的反应性舒张存在严重敏感性降低、血管内膜增厚等，这些症状给予APN之后可显著改观。但是，脂联素对内皮舒张反应性调节的具体机制并不清楚；并且脂联素及其受体如何调节其下游信号通路及机制也需进一步的研究证实。与此同时，有研究表明，窖蛋白1（Caveolin-1）存在脚手架结构，可与eNOS相互作用，从而改变NO的释放，影响血管舒张功能。但是，脂联素对血管舒张功能的调节与Caveolin-1是否有关，尚无定论。
　　为此本实验设计如下：（1）应用脂联素及其受体基因敲除小鼠模型，观察生理量脂联素对其血管舒张功能的影响，以明确生理量APN对血管内皮功能的调节作用。（2）应用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）观察脂联素如何通过脂联素受体影响内皮功能。（3）探讨脂联素对其受体后信号NO生成及内皮一氧化氮合酶（eNOS）活性影响，进而解释脂联素对血管张力影响的机理。因而，本实验的研究目的为：
　　1、明确APN对小鼠血管内皮功能的改善效应和对NO产生的影响；
　　2、探索APN对HUVEC中eNOS的影响，进而揭示脂联素I型和II型受体在eNOS活性调节中的作用；
　　3、探讨Caveolin-1是否参与脂联素受体诱导eNOS磷酸化过程，从而改善主动脉内皮功能。
　　方法：
　　1、选用6-8周龄正常C57BL野生型小鼠（WT），AdipoR1基因敲除小鼠（Adipo-R1KO），AdipoR2基因敲除小鼠（AdipoR2KO），Cav-1基因敲除小鼠（Cav-1KO），取其主动脉，以生理量脂联素（5μg/ml）孵育15 min，观测脂联素对内皮舒张功能， NO生成的影响；
　　2、原代培养HUVEC，并将培养的HUVEC分为5组：（1）对照组；（2）脂联素组:脂联素（终浓度为0，5，10和15μg/ml）作用0，15，30和60min；（3）脂联素+AdipoR1 siRNA组:AdipoR1siRNA终浓度50nM，5μg/ml脂联素作用15min；（4）脂联素+AdipoR2 siRNA组： AdipoR2 siRNA终浓度50nM，5μg/ml脂联素作用15min；（5）脂联素+Cav-1 siRNA组:Cav-1 siRNA终浓度50nM，5μg/ml脂联素作用15min；
　　3、Western Blot技术测定各组HUVEC中eNOS和p-eNOS的蛋白表达量；
　　4、应用基因沉默技术分别将HUVECs中AdipoR1、AdipoR2及Cav-1基因沉默；
　　5、提取50μl细胞上清直接上NO检测仪，以NaNO2为标准品作标准曲线，化学发光法检测总NOx含量。
　　结果：
　　1、生理量脂联素能增加小鼠血管的内皮依赖性舒张效应，显著改善血管内皮功能并且这种效应依赖于NO；
　　2、脂联素处理AdipoR1基因敲除小鼠，主动脉对ACh的舒张反应显著降低，脂联素处理AdipoR2基因敲除小鼠，主动脉对ACh的舒张反应无明显影响；
　　3、脂联素对Cav-1KO小鼠的血管舒张反应降低；
　　4、不同浓度及时间脂联素对HUVECs一氧化氮合酶磷酸化（p-eNOS）的影响，5μg/ml脂联素干预内皮细胞，eNOS磷酸化程度在15min时表达最高，NO生成水平也最高；
　　5、siRNA抑制AdipoR1的表达后，与AdipoR1未抑制组相比，脂联素(5μg/ml)调节内皮细胞eNOS的磷酸化水平程度明显降低，然而， AdipoR2 KD后，与AdipoR2未沉默组相比，脂联素对内皮细胞eNOS的磷酸化程度无明显变化；
　　6、 Caveolin-1 KD，显著阻断了脂联素（5μg/ml）诱导的内皮细胞eNOS的磷酸化和NO的产生。
　　结论:
　　1、生理量APN通过增加NO的产生从而对小鼠血管内皮功能具有改善效应；
　　2、APN通过脂联素I型受体增加eNOS的磷酸化水平及NO的分泌，而II型受体对脂联素诱导eNOS及NO生成影响不显著。在内皮细胞，I型II型受体在对脂联素诱导的eNOS表达及活性调节中体现明显的差异性；
　　3、Caveolin-1与脂联素I型受体相互作用共同调节eNOS磷酸化及NO的分泌，从而对血管内皮产生保护作用。

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前言

第一部分 APN对小鼠血管内皮舒张功能的调节效应及对NO产生的影响

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第二部分 脂联素通过脂联素受体1/Caveolin-1诱导eNOS磷酸化作用可改善主动脉内皮功能

1 材料和方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述: 脂联素与心血管疾病的相关性研究

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