小鼠丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶SRPK2在精子发生过程中的表达及作用分析

摘要

目的：
　　首先对前期酵母双杂交筛选的精子发生相关基因3(Spermatogenesis associated3， spata3)相关蛋白进行生物信息学分析，继而检测目标基因的组织特异性及阶段特异性表达情况，从中选择在睾丸组织大量表达并具有明显阶段特异性的基因作为本研究的具体靶标。进一步从蛋白水平分析靶标基因编码蛋白的组织、细胞定位，同时，运用分子克隆技术构建靶基因的真核表达载体，建立稳定转染过表达Hela细胞模型，在细胞水平探讨该基因的潜在功能，为揭示该基因在精子发生过程中的作用和意义提供更多实验素材。
　　方法：
　　1.通过生物信息学方法对spata3相互作用蛋白进行分析和预测；
　　2.分别采用半定量逆转录聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹杂交技术(Western blotting)分析候选基因mRNA及其蛋白在小鼠多种组织中的表达；
　　3.利用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)检测各基因mRNA在小鼠睾丸不同发育阶段的差异表达；
　　4.通过 Western blotting检测目标基因编码产物在不同周龄的小鼠睾丸中的阶段差异性表达；
　　5.应用免疫组织化学和免疫荧光技术观察目标基因编码蛋白在小鼠曲精小管和生精细胞中的定位；
　　6.通过分子克隆技术构建目标基因真核表达重组质粒；
　　7.将重组质粒转染 Hela细胞，建立过表达模型，分别采用RT-PCR和 Western blotting检测细胞中靶基因的表达；
　　8.利用MTT法在细胞水平检测转染和未转染细胞的增殖状况；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化。
　　结果：
　　1.利用生物信息学对酵母双杂交筛选的spata3相关作用蛋白进行分析，推测常染色质组蛋白赖氨酸 N-甲基转移酶2(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase2, Ehmt2)，突触素样蛋白(synaptophysin-like protein, Sypl)，环指和 CHY锌指结构域1(ring finger and CHY finger domain containing1, Rchy1)和丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase2, SRPK2)可能在精子发生过程中与spata3有密切联系；
　　2.半定量RT-PCR和Western blotting分析显示SRPK2和Sypl的mRNA和蛋白在小鼠睾丸中均大量表达；
　　3.实时定量PCR结果显示SRPK2 mRNA的表达趋势呈规律性增强，具有明显的阶段特异性表达特征；
　　4.Western blotting在蛋白水平检测到SRPK2蛋白有明显的阶段特异性表达；
　　5.免疫组化和免疫荧光染色结果表明SRPK2蛋白主要位于长形精子细胞核表面；
　　6.双酶切分析及DNA序列测定结果均表明真核表达质粒p3×Flag-SRPK2构建成功；
　　7.经RT-PCR和Western blotting检测，SRPK2基因在转染后的Hela细胞内过表达；
　　8.过表达SRPK2的Hela细胞增殖率明显高于对照组细胞(P<0.05)，使G1期明显降低(P<0.05)，凋亡率明显减少(P<0.05)。
　　结论：
　　1.SRPK2基因在小鼠睾丸中高表达，并具有显著的阶段特异性表达特征和明确的细胞定位，极有可能在小鼠精子发生的变态成形期参与mRNA前体分子的剪接过程；
　　2.成功构建了 SRPK2基因的真核表达重组质粒，建立了稳定过表达细胞模型，为后期研究奠定了实验基础；
　　3.SRPK2可以促进Hela细胞增殖，抑制Hela细胞早期凋亡，并使G1期缩短，促进DNA合成，其作用机制值得进一步探讨。

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常用缩写词中英文对照表

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1 生物信息学分析结果

2.2 半定量RT-PCR分析各基因mRNA在小鼠多种组织中的表达

2.3 Western blotting分析各蛋白在小鼠不同组织中的表达

2.4 实时定量PCR检测各基因mRNA的阶段特异性表达

2.5 Western blotting分析SRPK2蛋白在小鼠睾丸的阶段特异性表达

2.6 免疫组化染色检测SRPK2蛋白在曲精小管中的细胞定位

2.7 免疫荧光检测SRPK2蛋白在生精细胞中的亚细胞定位

2.8 小鼠睾丸高表达基因SRPK2真核表达载体的构建

2.9 真核表达重组质粒p3×Flag-SRPK2在Hela细胞中的表达

2.10 过表达SRPK2基因对Hela细胞的影响

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述: 丝/精氨酸蛋白激酶 SRPK 家族的研究进展

致谢

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