过表达PSMB5抑制人骨髓间充质干细胞衰老进程

摘要

目的：
　　探究20S蛋白酶体β5亚单位（PSMB5）在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)衰老进程中的影响，旨在揭示蛋白酶体活性对细胞衰老的影响，为延缓细胞的衰老指出一条可行性策略，以期为干细胞临床治疗研究提供新的思路。
　　方法：
　　分别构建PSMB5与绿荧光蛋白（GFP）融合表达的慢病毒载体感染体外培养晚期的hBMSCs，并依照感染病毒的不同将细胞分为PSMB5实验组和GFP对照组。1.通过Real-time PCR和Western bloting验证PSMB5过表达效率。2.应用荧光分光光度法检测20S蛋白酶体活性。3.利用溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）免疫荧光染色观察增殖情况，通过Western来检测细胞周期相关的蛋白：P21、Cyclin D1、CDK4的表达变化。4.应用SA-β-gal染色法观察hBMSCs衰老情况。5.在培养基中加入不同浓度（0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM）的H2O2，形成氧化损伤环境加速细胞衰老，探讨氧化环境对细胞损伤、衰老的影响，应用CCK-8法测定氧化应激条件下hBMSCs的细胞活性。
　　结果：
　　1. Real-time PCR结果显示PSMB5-mRNA水平亦较GFP组显著提高5.24±0.22倍（P<0.01），同时20S蛋白酶体其余亚单位PSMB1、PSMB2、PSMB6的mRNA水平变化无统计学意义；Western bloting结果显示PSMB5基因过表达后在实验组中PSMB5蛋白表达水平约为GFP组的2.70±0.19倍（P<0.01）。2. PSMB5组中20S蛋白酶体活性升高，相较GFP组为1.55±0.21倍（P<0.05）。3.在BrdU免疫荧光实验中，PSMB5组的BrdU阳性细胞数为37.91％±1.82%，而GFP组阳性细胞数为28.18%±1.98%（P<0.01）。免疫印迹检测提示PSMB5组中细胞周期相关蛋白表达水平较GFP组明显上调，P21上调1.45±0.05倍（P<0.01）、Cyclin D1上调1.56±0.16倍（P<0.01）、CDK4上调1.23±0.06倍（P<0.05）。4. SA-β-gal染色结果显示PSMB5组中衰老阳性细胞数40%±3.7%较GFP组的55%±3%偏低（P<0.01）。5. CCK-8法检测细胞活性检测结果表明，细胞活性与 H2O2浓度之间存有一定的依赖性， hBMSCs的细胞活力会随H2O2的孵育浓度升高而降低（P<0.01）；而在相同的H2O2浓度下，PSMB5组中hBMSCs具有较高的细胞活性，其中当H2O2的孵育浓度为300μM时的OD值之比约为2.11±0.23倍（P<0.01），而当浓度为500μM时，两组间没有统计学意义；测定当H2O2的孵育浓度为300μM时20S蛋白酶体活性的结果发现PSMB5组中20S蛋白酶体活性升高，相较GFP组为1.37±0.12倍（P<0.01）。说明在氧化应激的条件下，PSMB5过表达可以保护细胞活力，防止细胞衰老。
　　结论：
　　1.过表达PSMB5可以增强hBMSCs20S蛋白酶体活性，提高细胞增殖能力，延缓衰老。2.氧化环境中，过表达PSMB5可以保护hBMSCs因氧化应激产生的损伤，使细胞仍保持较高的活性，抑制了细胞衰老进程。提示PMSB5可能是抑制细胞衰老提高细胞活力的重要靶点。

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常用缩写词中英文对照表

前言

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 实验方法

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 PSMB5基因过表达效率

2.2 hBMSCs蛋白酶体活性的变化

2.3 hBMSCs增殖能力的变化

2.4 衰老相关SA-β-gal染色

2.5 氧化应激后 hBMSCs的细胞活性变化

3 讨 论

3.1 hBMSCs简介

3.2 hBMSCs的衰老

3.3 蛋白酶体对hBMSCs功能的作用

3.4 过表达PSMB5对hBMSCs衰老的影响

4 结 论

参考文献

综述: 骨髓间充质干细胞衰老的研究进展

致谢

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