自噬对TRAIL诱导Hela细胞凋亡的影响

摘要

目的：本实验初步探讨自噬对肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体（TRAIL）诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的影响，为将TRAIL应用于宫颈癌治疗提供新的策略。
　　方法：
　　⑴体外培养人宫颈癌Hela细胞株。
　　⑵用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度TRAIL作用及TRAIL与3-甲基腺嘌呤（3-MA）或氯喹（CQ）联合作用的Hela细胞增殖活性，倒置显微镜下观察Hela细胞的形态变化。
　　⑶免疫荧光法（IF）对微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）、p62进行荧光染色，并在荧光显微镜下观察；用DAPI染色观察Hela细胞凋亡。
　　⑷用蛋白质印迹法检测 LC3B、p62及聚 ADP核糖聚合酶（PARP）蛋白的表达水平。
　　⑸数据分析用SPSS17.0软件，计量资料以均数±标准差表达，组间均数比较用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　⑴ TRAIL可抑制Hela细胞的增殖活性：不同浓度TRAIL处理Hela细胞48 h，Hela细胞的增殖活性随浓度增大而下降，半数抑制率浓度为6.54 ng/mL，选择TRAIL药物浓度在IC50值以下，2.0 ng/mL作为后续实验浓度。
　　⑵3-MA或CQ增强TRAIL对Hela细胞的增殖抑制作用：TRAIL与3-MA或CQ联合作用于Hela细胞其增殖活性与单独使用TRAIL或3-MA或CQ组相比明显降低，差异有显著意义。
　　⑶ TRAIL可诱导Hela细胞发生自噬：TRAIL作用于Hela细胞，Hela细胞内LC3聚集体增多，LC3荧光点及LC3Ⅱ蛋白水平升高，说明TRAIL可诱导Hela细胞内自噬体的形成；TRAIL与CQ联合作用于Hela细胞较单独TRAIL或CQ作用，LC3聚集体显著增加，LC3荧光点及LC3Ⅱ蛋白水平显著升高，证实LC3聚集是由自噬活性增强引起的；3-MA、TRAIL与3-MA联合作用于Hela细胞，LC3荧光点及LC3Ⅱ蛋白水平降低，提示3-MA可抑制自噬。
　　TRAIL组与 control组相比，p62荧光点及蛋白水平明显降低；加入自噬抑制剂组（CQ、TRAIL+CQ、3-MA、TRAIL+3-MA组）p62荧光点及蛋白水平较TRAIL组升高。总之，TRAIL可诱导Hela细胞发生自噬；3-MA、CQ可抑制细胞自噬。
　　⑷3-MA或CQ明显增强TRAIL诱导的Hela细胞凋亡：DAPI染色发现，TRAIL与3-MA或CQ联合作用 Hela细胞的凋亡率与单独使用TRAIL或3-MA或CQ比较明显增高，差异有统计学意义。
　　⑸3-MA或CQ增强TRAIL诱导的凋亡相关蛋白的表达：TRAIL与3-MA或CQ联合作用于Hela细胞，cleavage-PARP的表达较TRAIL组显著增加，差异有意义。
　　结论：
　　1. TRAIL可抑制Hela细胞的增殖活性，并且呈剂量依赖性。
　　2. TRAIL在诱导Hela细胞凋亡的同时也可诱导自噬的发生，且自噬对Hela细胞的存活起保护作用。
　　3.抑制自噬可增强TRAIL诱导的Hela细胞凋亡。

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前言

1 材料与方法

1.1细胞株

1.2主要试剂和仪器

1.3主要试剂的配制

1.4实验方法

1.5统计学分析

2 结 果

2.1 TRAIL抑制Hela细胞的增殖活性

2.2 3-MA或CQ明显增强TRAIL对Hela细胞的增殖抑制作用

2.3 TRAIL诱导Hela细胞发生自噬

2.4 3-MA或CQ明显增强TRAIL诱导的Hela细胞凋亡

2.5 3-MA或CQ增强TRAIL诱导的凋亡蛋白的表达

3 讨 论

3.1 TRAIL对Hela细胞增殖活性的影响

3.2 TRAIL诱导Hela细胞发生自噬

3.3 3-MA或CQ抑制自噬对TRAIL诱导Hela细胞凋亡的影响

4 结 论

参考文献

综述:TRAIL及其作用机制

致谢

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