多环芳烃类化合物苯并芘对人脐静脉内皮细胞血栓调节蛋白表达的影响及机制研究

摘要

目的：
　　环境因素对心血管系统的影响愈发加重，烟草、石油等高分子有机物质不完全燃烧产生的多环芳烃类化合物苯并芘具有显著的致癌作用，近年发现苯并芘能够影响内皮细胞的生理功能，参与动脉粥样硬化进展，包括损害及斑块形成。血栓调节蛋白广泛表达在内皮细胞上，参与内皮细胞的抗炎、抗凝等作用，苯并芘是否会影响血栓调节蛋白的报道少见。Krüppel样转录因子2被称为内皮细胞的“分子开关”，可以通过多种途径影响内皮细胞生理功能，使其处于功能静止状态，有研究显示Krüppel样转录因子2可以上调血栓调节蛋白的表达。本研究探讨苯并芘对人内皮细胞表面血栓调节蛋白的影响及Krüppel样转录因子2在这一影响中的作用。
　　方法：
　　分离培养原代人脐静脉内皮细胞，VIII因子鉴定，第2~4代细胞用于实验。分组：对照组：0.1％DMSO组，阳性对照组：20ng/ml TNF-a组，实验组：四种不同浓度0.1mg/L,1mg/L,2mg/L,5mg/L的苯并芘溶液组，共六组。
　　①CCK8方法检测0.1%DMSO及不同浓度苯并芘溶液不同时间(6h,24h)干预细胞后，各组的吸光度A值；
　　②以上浓度组不同时间(6h,24h)干预细胞及2mg/L苯并芘溶液不同时间(0h,1h,6h,12h,24h)干预细胞，荧光二抗标记血栓调节蛋白抗体已标记的细胞，每组分别计数10000个细胞，流式细胞仪检测并比较各组的平均荧光强度；
　　③各浓度组不同时间(6h,24h)干预细胞及2mg/L苯并芘溶液(0h,1h,6h,12h,24h)干预细胞后，SYBR Green染料法RT-PCR检测各组TM mRNA的表达；
　　④各浓度组24h干预细胞及2mg/L苯并芘溶液不同时间(0h,1h,6h,12h,24h)干预细胞后，利用SYBR Green染料法进行RT-PCR检测各组LKLF mRNA的表达；
　　⑤分别用LKLF siRNA，Control siRNA-A转染细胞24小时后，再次用0.1%DMSO、2mg/L苯并芘溶液分别孵育细胞24h，比较各组TM的平均荧光强度及TM mRNA的表达。
　　结果：
　　①低倍镜下观察，细胞的形状为短梭形、多角形，核仁清晰。VIII因子鉴定：95%以上的细胞染色阳性,含有棕色颗粒，为内皮细胞。
　　②24h组中，2mg/L，5mg/L组与对照组的差异有统计学意义(P＜0.05)。6h组虽然有随着浓度升高吸光度A值下降的趋势，但无统计学差异(P＞0.05)；
　　③6h及24h组均可观察到随着苯并芘的浓度升高TM平均荧光强度较对照组有下降的趋势，6h组差异无统计学意义(P＞0.05)，24h组浓度达到0.1mg/L时的荧光强度即有统计学差异(P＜0.05)，同一浓度2mg/L组中，平均荧光强度有随着时间延长而下降的趋势，同0h相比较，1h及24h处平均荧光强度差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　④与对照组相比，6h及24h组均可观察到随着苯并芘的浓度升高TMmRNA相对表达量2-△△Ct值有下降的趋势，其中6h组浓度达2mg/L时2-△△Ct值便有统计学差异(P＜0.05)，24h组中浓度达到0.1mg/L时即有统计学差异(P＜0.05)，在2mg/L组中，2-△△Ct值有随着时间延长而下降的趋势，同0h相比较，达到1h处差异便有统计学意义(P＜0.05)。
　　⑤不同浓度组可以观察到随着苯并芘浓度的升高，KLF2mRNA的表达量降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)；同一浓度2mg/L不同时间组间均有统计学差异(P＜0.05)。
　　⑥相对于control siRNA-A，各组间TM蛋白及TMmRNA表达均有所下降(P＜0.05)。与LKLF siRNA组相比较，LKLF siRNA+2mg/L组的TM蛋白平均荧光强度和TMmRNA相对表达量下降明显减少(P＜0.05)。
　　结论：
　　苯并芘一定程度上抑制HUVECs的增殖、血栓调节蛋白的表达及KLF2 mRNA的生成量，且通过转录后基因沉默KLF2 mRNA或许可以干预苯并芘对TM的影响。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

1 材料与方法

1.1 实验仪器

1.2 实验材料

1.3实验方法

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 原代HUVECs及鉴定

2.2 CCK-8法检测苯并芘对HUVECs增殖的影响

2.3 流式细胞仪检测苯并芘不同条件下对HUVECs表面TM蛋白表达的影响

2.4 RT-PCR检测苯并芘对HUVECs TM mRNA表达的影响

2.5 RT-PCR检测苯并芘对HUVECs KLF2 mRNA表达的影响

2.6 流式细胞仪检测siRNA干扰KLF2 mRNA对苯并芘影响HUVECs表面TM蛋白表达的作用及RT-PCR检测siRNA干扰KLF2 mRNA对苯并芘影响HUVECs TM mRNA表达的作用

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述:苯并芘的心血管毒性研究进展

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