烟草中焦油与尼古丁对血栓调节蛋白表达和血栓调节蛋白与凝血酶相互作用的影响及瑞舒伐他汀的干预

摘要

吸烟是心血管疾病的独立危险因素。在临床实践及以往文献报道发现吸烟可以导致血管内血栓形成，引起急性心肌梗死的发生。但其机制目前并不清楚。内皮细胞在维持血流通畅、抵抗血栓形成等方面发挥着关键作用。血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）是内皮细胞表面具有很强抗凝活性的蛋白，它主要通过与凝血酶1∶1的高亲和力结合，激活蛋白C发挥抗凝作用。这一抗凝过程不但受TM表达量的影响，同时也受其与凝血酶相互作用的影响。目前体外观察吸烟对内皮细胞TM表达的研究较少，焦油、尼古丁作为烟草中两种重要的有害物质，被人们广泛研究，但罕见报道其对内皮细胞TM表达的影响。瑞舒伐他汀作为新一代的降脂药，不仅具有调节血脂的功能，还具有抗炎，抗血栓，改善血管内皮功能，稳定斑块等作用。但瑞舒伐他汀是否改善焦油与尼古丁对TM的表达并不清楚。另外，关于TM与凝血酶相互作用的研究，原子力显微镜(atomic forcemicroscopy，AFM)单分子力谱(single-molecule force spectroscopy，SMFS)以其pN级的高分辨率实现了在活细胞表面单分子水平作用力的测定而具有独特的优越性。虽然近年来采用原子力显微镜对于生物分子间相互作用的研究越来越多，并不断获得新的进展，但是关于焦油与尼古丁对TM/凝血酶单分子间的相互作用及瑞舒伐他汀的干预的研究未见报道。
　　第一部分焦油与尼古丁对血栓调节蛋白表达的影响
　　目的:研究不同条件下焦油与尼古丁对人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cells，HUVECs)的增殖影响及表面TM表达的影响，从而探讨吸烟导致血管内血栓形成的可能机制。
　　方法:以0.1％Ⅰ型胶原酶消化人脐静脉内皮37℃15-20min，分离获得原代HUVECs，在37℃、5％CO2孵箱内培养至融合后传代，用Ⅷ因子相关抗原鉴定HUVECs，2-3代细胞用于实验。
　　1、CCK-8法检测焦油与尼古丁对HUVECs增殖的影响
　　将HUVECs接种于96孔板，用不同浓度焦油（50mg/L，20 mg/L，10 mg/L,1 mg/L)、尼古丁（10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)不同时间(6h、24h)孵育细胞。培养结束后，每孔加入10ul CCK-8溶液37℃，5％CO2孵箱内培养1-4h，酶标仪450nm波长测定吸光度A值。
　　2、流式细胞仪检测焦油与尼古丁对HUVECs表面TM蛋白表达的影响
　　将HUVECs接种于6孔板，用不同浓度焦油(50mg/L、20mg/L、10mg/L、1mg/L)、尼古丁(10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)同一时间(6h)及同一浓度20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁不同时间(0h、1h、6h、12h、24h)孵育细胞。流式细胞计数每组细胞平均荧光强度，检测TM蛋白表达，每次计数30000个细胞。
　　3、荧光定量PCR检测焦油与尼古丁对HUVECs表面TM mRNA表达的影响
　　将HUVECs接种于6孔板，用不同浓度焦油(50mg/L、20mg/L、10mg/L、1mg/L)、尼古丁(10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)同一时间(6h)及同一浓度20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁不同时间(0h、1h、6h、12h、24h)孵育细胞。荧光定量PCR检测TM mRNA表达。
　　结果:
　　1、CCK-8法检测焦油与尼古丁对HUVECs增殖的影响
　　与对照组相比，不同浓度焦油6h、24h组均可观察到随浓度的升高，A值逐渐降低的趋势，但只有50mg/L焦油6h、24h组有统计学差异(P＜0.05)。而不同浓度尼古丁6h、24h组与对照组相比可观察到随浓度的升高，A值逐渐升高的趋势，但均无统计学差异。
　　2、流式细胞仪检测焦油与尼古丁对HUVECs表面TM蛋白表达的影响
　　与对照组相比，不同浓度焦油组可以观察到随着焦油浓度的升高TM蛋白表达逐渐增加，呈浓度依赖性，而且10mg/L焦油组即可达统计学差异(P＜0.05)。与0h相比，不同时间焦油组也可观察到随着时间的延长TM蛋白表达逐渐增加，呈时间依赖性，而且6h即可达统计学差异(P＜0.05)。并且观察到6h内焦油组TM蛋白表达量增加最快，而随时间延长，TM蛋白表达量增加速率则逐渐减慢。尼古丁组随浓度、时间变化均对HUVECs表面TM蛋白表达无影响。
　　3、荧光定量PCR检测焦油与尼古丁对HUVECs表面TM mRNA表达的影响
　　与对照组相比，不同浓度焦油组可以观察到随着焦油浓度的升高TMmRNA表达逐渐增加，呈浓度依赖性，而且1mg/L焦油组即可达统计学差异(P＜0.05)。与0h相比，不同时间焦油组也可观察到随着时间的延长TM mRNA表达逐渐增加，呈时间依赖性，而且1h即可达统计学差异(P＜0.05)。并且观察到6h内焦油组TM mRNA表达量增加最快，而随时间延长，TM mRNA表达量增加速率则逐渐减慢。尼古丁组随浓度、时间变化均对HUVECs表面TM mRNA表达无影响。
　　结论:
　　1、焦油抑制HUVECs的增殖。尼古丁具有增强HUVECs增殖的趋势。
　　2、焦油增加HUVECs表面TM的表达，呈浓度、时间依赖性。尼古丁对HUVECs表面TM的表达无影响。
　　第二部分瑞舒伐他汀干预焦油与尼古丁对血栓调节蛋白表达及活性的影响
　　目的:研究瑞舒伐他汀干预焦油与尼古丁对HUVECs的增殖影响及表面TM表达及活性的影响，从而探讨他汀类药物改善吸烟致血管内血栓形成的可能机制。
　　方法:以0.1％Ⅰ型胶原酶消化人脐静脉内皮37℃15-20min，分离获得原代HUVECs，在37℃、5％CO2孵箱内培养至融合后传代，第2-3代细胞用于实验。
　　1、CCK-8法检测瑞舒伐他汀干预焦油与尼古丁对HUVECs增殖的影响
　　将HUVECs接种于96孔板，用50mg/L焦油、10-3mol/L尼古丁、50mg/L焦油+50umol/L他汀，10-3mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀不同时间(6h、24h)孵育细胞。培养结束后，每孔加入10ul CCK-8溶液37。C，5％CO2孵箱内培养1-4h，酶标仪450nm波长测定吸光度A值。
　　2、流式细胞仪检测瑞舒伐他汀干预焦油与尼古丁对HUVECs表面TM蛋白表达的影响
　　将HUVECs接种于6孔板，用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20mg/L焦油+50umol/L他汀，10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀孵育细胞。流式细胞计数每组细胞平均荧光强度，检测TM蛋白表达，每次计数30000个细胞。
　　3、荧光定量PCR检测瑞舒伐他汀干预焦油与尼古丁对HUVECs表面TM mRNA表达的影响
　　将HUVECs接种于6孔板，用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20 mg/L焦油+50umol/L他汀，10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀孵育细胞。荧光定量PCR检测TM mRNA表达。
　　4 TM活性实验检测焦油与尼古丁对HUVECs表面TM活性的影响及瑞舒伐他汀的干预
　　将HUVECs接种于96孔板，用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20mg/L焦油+50umol/L他汀，10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀不同时间(6h、24h)孵育细胞。酶标仪405nm波长测定吸光度A值。
　　结果:
　　1、CCK-8法检测瑞舒伐他汀干预焦油与尼古丁对HUVECs增殖的影响
　　与50mg/L焦油组相比，他汀+焦油组可增加吸光度A值(P＜0.05);但与对照组相比，他汀组无明显统计学差异。他汀+尼古丁组与尼古丁组也无明显统计学差异。
　　2、流式细胞仪检测瑞舒伐他汀干预焦油与尼古丁对HUVECs表面TM蛋白表达的影响
　　与对照组相比，他汀组可增加HUVECs表面TM蛋白表达(P＜0.05);与焦油组相比，他汀+焦油组可增加HUVECs表面TM蛋白表达(P＜0.05);与尼古丁组相比，他汀+尼古丁组可增加HUVECs表面TM蛋白表达（P＜0.05）。
　　3、荧光定量PCR检测瑞舒伐他汀干预焦油与尼古丁对HUVECs表面TM mRNA表达的影响
　　与对照组相比，他汀组可增加HUVECs表面TM mRNA表达(P＜0.05);与焦油组相比，他汀+焦油组可增加HUVECs表面TM mRNA表达(P＜0.05);与尼古丁组相比，他汀+尼古丁组可增加HUVECs表面TM mRNA表达(P＜0.05)。
　　4、TM活性实验检测焦油与尼古丁对HUVECs表面TM活性的影响及瑞舒伐他汀的干预
　　与对照组相比，焦油组降低吸光度A值，降低TM的活性(P＜0.05);与焦油组相比，他汀+焦油组可增加吸光度A值（P＜0.05）;而尼古丁组与对照组相比吸光度A值无统计学差异，他汀+尼古丁组及他汀组与对照组相比可增加吸光度A值(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、瑞舒伐他汀能改善焦油抑制的HUVECs增殖，但本身对HUVECs的增殖无影响。
　　2、瑞舒伐他汀可增加HUVECs表面TM的表达，并在焦油增加TM表达的基础上，仍能再次上调TM的表达。
　　3、焦油降低TM活性，瑞舒伐他汀可改善这一效应，并且瑞舒伐他汀本身也可增加TM的活性。尼古丁对TM活性无影响。
　　第三部分单分子力谱检测焦油与尼古丁对血栓调节蛋白与凝血酶相互作用的影响及瑞舒伐他汀的干预
　　目的:利用单分子力谱法检测焦油与尼古丁对TM与凝血酶单分子水平相互作用及瑞舒伐他汀的干预，从而探讨吸烟导致血管内血栓形成及他汀类药物抗血栓作用的可能机制。
　　方法:
　　1、pTM-GFP重组质粒转染COS-7细胞及AFM分组测力
　　实验分组:1）空白对照组（无质粒转染）;2）对照组（质粒转染）;3)50mg/L焦油孵育转染细胞1h组（焦油组）;4）10-3mol/L尼古丁孵育转染细胞1h组（尼古丁组）;5）50umol/L瑞舒伐他汀+50mg/L焦油孵育转染细胞1h组（他汀+焦油组）;6）50umol/L瑞舒伐他汀+10-3mol/L尼古丁孵育转染细胞1h组（他汀+尼古丁组）;7）50umol/L瑞舒伐他汀孵育转染细胞1h组（他汀组）。采用AFM及荧光倒置显微镜联用系统，在荧光倒置显微镜下观察各组细胞表达的TM荧光融合蛋白聚集区，用凝血酶修饰的AFM探针反复随机的在细胞表面蛋白聚集区下压-回拉，获得力-距离曲线，统计得出TM与凝血酶间结合力的高斯分布及成键几率。
　　2、流式细胞仪检测焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀对COS-7细胞表面TM荧光蛋白表达的影响
　　将转染后的COS-7细胞接种于6孔板，用50mg/L焦油、10-3mol/L尼古丁、50mg/L焦油+50umol/L他汀，10-3mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀孵育细胞1h。流式细胞计数每组细胞平均荧光强度，检测TM蛋白表达，每次计数30000个细胞。
　　结果:
　　1、AFM检测焦油与尼古丁对TM与凝血酶之间的相互作用及瑞舒伐他汀的干预
　　与对照组相比，焦油组可明显降低TM与凝血酶间结合几率(P＜0.05)，所得结合几率低至＜5％，可视为分子间结合极低或无结合，无法计算TM与凝血酶间的分子结合力;与焦油组相比，他汀+焦油组可明显增加TM与凝血酶间结合几率(P＜0.05)，达到与对照组相当的水平，并且计算得出的他汀+焦油组的分子结合力明显高于对照组（P＜0.05）。而尼古丁组与对照组相比在结合几率和结合力上均无统计学差异;他汀+尼古丁组与尼古丁组相比结合几率虽无统计学差异，但是结合力却明显增加（P＜0.05）;他汀组与对照组相比结合几率也无统计学差异，但结合力明显增加（P＜0.05）。
　　2、流式细胞仪检测焦油与尼古丁对COS-7细胞表面TM荧光蛋白表达的影响及瑞舒伐他汀的干预
　　与对照组相比，焦油组与他汀+焦油组可明显增加COS-7细胞表面TM表达（P＜0.05）;尼古丁组、他汀组及尼古丁+他汀组与对照组相比均无统计学差异。
　　结论:
　　1、焦油能降低TM与凝血酶间结合几率，瑞舒伐他汀可改善这一效应，但瑞舒伐他汀本身对TM与凝血酶间结合几率无影响。尼古丁对TM与凝血酶间结合几率及结合力均无影响。加入瑞舒伐他汀后，各组均能增加TM与凝血酶间结合力。
　　2、焦油可增加转染后COS-7细胞表达TM，尼古丁、瑞舒伐他汀对转染后COS-7细胞表达TM无影响。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 焦油与尼古丁对血栓调节蛋白表达的影响

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 瑞舒伐他汀干预焦油与尼古丁对血栓调节蛋白表达及活性的影响

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 单分子力谱检测焦油与尼古丁对血栓调节蛋白与凝血酶相互作用的影响及瑞舒伐他汀的干预

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 吸烟、内皮细胞功能紊乱和动脉粥样硬化

致谢

个人简历