多巴胺对大鼠胰岛素分泌的影响及可能作用机制

摘要

目的：
　　多巴胺在中枢神经系统中发挥重要的调节作用，在外周也影响着机体的某些功能。本实验通过离体胰岛素分泌实验，膜片钳和钙成像技术探讨多巴胺对大鼠胰岛素分泌的影响以及相关的作用机制。
　　方法：
　　（1）雄性wistar大鼠断头处死后，将1g·L-1胶原酶P溶液缓慢的注入到胆总管中,分离的胰腺经37℃水浴消化、 Histopaque1077梯度离心得到单个胰岛。使用5g·L-1的Dispase II消化胰岛，将得到的胰岛细胞放入孵箱内备用。（2）分得的胰岛经过夜修复后，采用放射免疫分析法测得不同药物干预后胰岛素含量的变化。（3）应用全细胞膜片钳技术记录经过多巴胺、D2-like受体激动剂 Quinpirole以及阻断剂Eticlopride分别干预后，对胰岛β细胞电压依赖性钾通道（Kv）、电压依赖性钙通道和动作电位（AP）的影响。（4）应用钙成像技术检测灌注多巴胺和Quinpirole后对胰岛细胞内钙离子浓度的影响。
　　结果：
　　（1）采用胶原酶P消化、1077梯度离心所得到的胰岛，形态规整，多成圆形或椭圆形，表面光滑，质地饱满，直径约在100~300μm之间，偶有少量胰岛与腺泡相连。Dispase II消化所得到的胰岛细胞，多成球体，表面圆滑，单个或多个细胞聚集分布。（2）胰岛素分泌试验中，多巴胺呈浓度依赖性抑制了胰岛素的释放，并随外界环境中糖浓度的升高抑制作用表现得更为显著。在16.7mM葡萄糖的基础上，10μM D1-like受体激动剂SKF38393对分泌的影响没有统计学差异；而在同样浓度葡萄糖的环境中，10μM D2-like受体激动剂 Quinpirole明显地抑制了胰岛素的释放（对照组，150.02±19.49μmol·L-1，n=6；Quinpirole组，91.70±6.66μmol·L-1，n=6，p<0.01）。10μM D2-like受体的阻断剂 Eticlopride对胰岛素的分泌没有影响（对照组，136.81±5.60μmol·L-1，n=6；Eticlopride组，123.32±11.59μmol·L-1，n=6，p>0.05)，但可以在很大程度上消除多巴胺对胰岛素分泌的影响（多巴胺组，47.24±6.35μmol·L-1， n=6；多巴胺+Eticlopride组，117.16±7.58μmol·L-1，n=6，p<0.001)。（3）膜片钳实验中，10μM多巴胺对胰岛β细胞上Kv电流有明显地促进作用，将电压钳制在80mV时，记录到多巴胺组（109.92±6.68 pA/pF，n=6）的电流密度，与对照组（69.79±2.96 pA/pF，n=6）相比p<0.001；10μM D2-like受体的激动剂Quinpirole对β细胞上Kv电流也有促进作用，电压钳制在80mV时，记录到Quinpirole组（123.85±8.27 pA/pF， n=6）的电流密度，与对照组（84.45±5.39 pA/pF，n=6）相比p<0.01。10μM D2-like受体阻断剂Eticlopride本身对Kv没有影响，但可以消除多巴胺对Kv电流的作用（对照组，84.87±3.50 pA/pF，n=6；Eticlopride组，76.24±3.76 pA/pF，n=6；Eticlopride+多巴胺组，81.58±3.85 pA/pF，n=6）。10μM多巴胺抑制了电压依赖性钙通道(对照组，-3.68±0.35pA/pF，n=6；多巴胺组，-2.74±0.48 pA/pF，n=6，p<0.05)，而10μM D2-like受体的激动剂Quinpirole对钙通道没有影响。10μM多巴胺明显缩短了动作电位的时程（对照组，59.58±4.69 ms，n=6；多巴胺组，32.97±3.17ms，n=6，p<0.001），而10μM D2-like受体阻断剂 Eticlopride可以消除多巴胺对动作电位时程的影响。（4）钙成像实验中，以2.8mM葡萄糖为基线，16.7mM葡萄糖使细胞内钙离子浓度升高，而10μM多巴胺和10μM D2-like受体的激动剂Quinpirole在16.7mM葡萄糖的基础上均使得细胞内钙离子浓度明显下降。
　　结论：
　　（1）使用胶原酶P和Dispase II消化所得到的胰岛和胰岛细胞功能状态良好。
　　（2）多巴胺和D2-like受体激动剂Quinpirole抑制大鼠胰岛素的释放，并且多巴胺的作用可以被D2-like受体的阻断剂Eticlopride很大程度上所消除。
　　（3）多巴胺和 Quinpirole都明显地促进了 Kv通道，而且多巴胺的作用可以被Eticlopride所消除。
　　（4）多巴胺抑制了电压依赖性钙通道，减少细胞外钙离子的内流，而 Quinpirole对钙通道并没有产生影响。
　　（5）多巴胺缩短了动作电位的时程，Eticlopride可以消除这一作用。（6）多巴胺和Quinpirole均使得细胞内钙离子浓度减少。
　　综上所述，多巴胺抑制大鼠胰岛素的释放，而这一抑制作用主要由D2-like受体所介导。多巴胺激活D2-like受体后，促进了电压依赖性钾通道，细胞复极增快，动作电位时程缩短，减少细胞外钙离子内流的时长，最终使细胞内钙离子浓度下降抑制胰岛素的释放。其次多巴胺也可以抑制电压依赖性钙离子通道，进一步发挥抑制作用。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

1 材料与方法

1.1药物与试剂

1.2 主要溶液的配置

1.3实验仪器

1.4实验动物

1.5大鼠胰岛的分离纯化及培养

1.6原代大鼠胰岛细胞的分离及培养

1.7大鼠胰岛素分泌实验

1.8膜片钳实验

1.9钙成像实验

1.10数据的处理及分析

2 结 果

2.1大鼠胰岛及胰岛β细胞的分离纯化及培养

2.2多巴胺对大鼠胰岛素分泌的影响

2.3 D1-like与D2-like受体对大鼠胰岛素分泌的影响

2.4多巴胺与D2-like受体激动剂对β细胞电压依赖性钾通道的影响

2.5多巴胺与D2-like受体激动剂对β细胞电压依赖性钙通道的影响

2.6多巴胺与D2-like受体阻断剂对β细胞动作电位时程的影响

2.7多巴胺与D2-like受体激动剂对β细胞内钙离子浓度的影响

3 讨 论

4 结 论

参考文献

致谢

个人简历