核磷酸酶SCP4在慢性肾脏病肌肉萎缩中作用机制的研究

摘要

肌肉萎缩是多种疾病的常见并发症；慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）及与其相关的炎性细胞因子刺激蛋白质能量消耗（protein energy wasting,PEW），这种复杂的过程表现为肌肉质量的持续丢失。而导致肌肉损失是一个复杂的病理生理过程，主要是加速蛋白质的降解实现的，然而这些蛋白质水解过程中的调控机制仍有待进一步研究。本课题主要研究核内小分子磷酸酶SCP4/CTDSPL2（the small C-terminal domain phosphatase4/the C-terminal domain small phosphatase like2）通过调节FoxO1、3信号通路影响肌肉蛋白质代谢；在CKD时由于NF-κB被激活而刺激SCP4表达增加，从而诱导肌肉蛋白降解。
　　第一部分：SCP4在肌肉蛋白代谢中的作用机制研究
　　目的：
　　旨在研究核磷酸酶SCP4/CTDSPL2如何通过调控FoxO转录因子影响肌肉蛋白质的代谢，为临床防治肌肉萎缩提供新的治疗靶点。
　　方法：
　　采用细胞电穿孔转染技术使成肌细胞C2C12的SCP4基因抑制或过表达。过表达及对照组分别转染GFP-SCP4和GFP，然后分别加入蛋白酶体和溶酶体抑制剂、IGF-1和BMP2处理细胞；在基因抑制组分别转染SCP4-siRNA(siSCP4)和scrambled(siCTL)。采用同位素检测技术检测蛋白质的分解和合成；PCR微阵列分析SCP4过表达时与骨骼肌代谢、功能及疾病相关的基因表达变化；磷酸化蛋白微阵列检测在细胞SCP4基因抑制后多种蛋白磷酸化水平的变化。采用western-blot检测各组Akt、FoxO1、FoxO3a的蛋白表达及SCP4的转染效率；Real-time PCR检测各组Atrogin-1、 MuRF-1、MUSA1、Myostatin的mRNA表达。激光共聚焦显微镜动态观察活细胞FoxO1出入细胞核的变化。采用电转染技术使局部肌肉SCP4过表达进行体内实验，免疫荧光染色观察肌纤维横截面积。
　　结果：
　　1)在骨骼肌细胞SCP4调控FoxOs和Smads信号通路；
　　2)SCP4过表达促进成肌细胞蛋白水解；
　　3)SCP4过表达促进肌肉损伤基因Atrogin-1、MuRF-1、MUSA1和Myostatin的表达；
　　4)过表达SCP4使FoxO1、FoxO3a去磷酸化增加，抑制其出核；
　　5)在正常小鼠中过表达SCP4也足以引起肌纤维萎缩。
　　结论：
　　SCP4通过调控FoxO1、FoxO3a的出入核，增加其转录活性，从而促进损伤因子的表达，诱导蛋白质水解，肌肉萎缩。即使磷酸化Akt发生变化，过表达SCP4也能使FoxO1留在细胞核内，表明SCP4的是一种新的FOxO转录因子和蛋白水解信号转导的调节因子，可能为预防肌肉萎缩提供治疗的新靶点。
　　第二部分：抑制SCP4基因可防止慢性肾脏病诱导的肌肉萎缩
　　目的：
　　旨在探讨抑制SCP4基因在饥饿及慢性肾脏病诱导的肌肉萎缩中的保护作用。
　　方法：
　　使用电转染技术使C2C12细胞SCP4基因敲抑，建立饥饿模型，转染scrambled组（siCTL）、转染scrambled+无血清培养（siCTL-SF）组、转染SCP4-siRNA（siSCP4）组、转染SCP4-siRNA+无血清培养组（siSCP4-SF），同位素法检测蛋白降解率；建立CKD小鼠模型，采用免疫组化及western-blot检测其骨骼肌以及健康成人和CKD患者腹直肌SCP4的蛋白表达；采用电穿孔转染技术使CKD小鼠局部肌肉SCP4基因敲抑，分为4组，假手术+转染scrambled组（Sham+siCTL）、CKD+转染scrambled组（CKD+siCTL）、假手术+转染siSCP4组（Sham+siSCP4）、CKD+转染SCP4组（CKD+siSCP4），肌纤维的横截面积用免疫荧光染色观察；western-blot检测各组Akt、FoxO1、FoxO3a的蛋白表达；Real-time PCR检测各组Atrogin-1、MuRF-1、MUSA1、Myostatin的mRNA表达。CKD相关的细胞因子IL-6，IFN-γ、LPS及其混合物和QNZ（NF-κB抑制剂）作用于C2C12细胞，检测细胞SCP4 mRNA和蛋白水平的变化；采用染色质免疫沉淀技术（ChIP assay）来检测NF-κB（p65）蛋白是否与SCP4基因启动子序列相关。
　　结果：
　　1) SCP4基因敲抑可以降低饥饿诱导的蛋白降解率，抑制FoxO1/3a的转录活性，降低肌肉损伤因子的表达；
　　2)慢性肾脏病时肌肉中核磷酸酶SCP4表达增加，抑制SCP4基因可以防止CKD小鼠的肌肉萎缩；
　　3)CKD相关炎性因子可以刺激肌细胞SCP4表达增加；转录因子NF-κB（p65）蛋白与SCP4基因启动子序列相关；QNZ处理C2C12细胞后，几乎完全阻断由细胞因子诱导的SCP4表达的增加。
　　结论：
　　CKD时NF-κB被激活从而介导SCP4的表达增加，刺激肌肉蛋白水解；抑制SCP4的表达可以预防CKD及饥饿诱导的肌肉萎缩。这一结论可能为临床防治CKD及其他代谢性疾病导致的肌肉萎缩提供新的治疗靶点。

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前言

参考文献：

第一部分 SCP4在肌肉蛋白质代谢中的作用机制研究

实验一 SCP4对蛋白磷酸化状态的影响

材料和方法

结果

实验二 过表达SCP4促进细胞蛋白水解

材料和方法

结果

实验三 SCP4促进蛋白水解的机制

材料和方法

结果

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 抑制SCP4基因可防止慢性肾脏病诱导的肌肉萎缩

实验一 SCP4基因敲抑抑制饥饿诱导的蛋白降解

材料与方法

结果

实验二 CKD时SCP4表达的变化及其机制

材料和方法

结果

实验三 抑制SCP4基因可减轻CKD诱导的肌肉萎缩

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

附表：

综述:转录因子FoxOs在维持骨骼肌稳态中的作用

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