运城盐湖多功能中度嗜盐菌的分离筛选及发酵条件优化

摘要

山西运城盐湖是一个富含芒硝、盐的特殊水体，因而土壤盐碱化严重。国内外学者对其微生物的研究相对较少。本实验对运城盐湖土壤中的产功能酶耐盐细菌进行分离鉴定，了解了该地区耐盐菌的产功能酶种类和特性。结合耐盐功能菌的一些生理生化特性，选用了不同功能酶筛选培养基，并在菌种筛选过程中不断优化实验条件，通过在培养基中加入酶特异性底物而有针对性的对产不同功能酶的菌株进行富集培养和分离筛选，同时对酶活性较高的菌株产酶发酵条件进行优化，以期为中度嗜盐菌产酶提供一定的理论依据。本文主要研究结果如下：
　　（1）实验共分离得到了20株产酶细菌，其中产淀粉酶的菌株有7株，产脂肪酶的菌株有4株，产蛋白酶的菌株有9株。其中产酶活性较高的菌株编号为YH-7、YH-8、YH6-1。之后将此3株菌分别经点接法接种到淀粉酶筛选培养基和脂肪酶筛选培养基中进行检测，发现菌株YH6-1也同时具有生产淀粉酶和脂肪酶的能力，是一株功能比较多的菌株。对这3株产酶活性较高的菌株进行形态学指标，生理生化指标及16S rDNA分子序列鉴定，结果显示：菌株YH-7（登录号：KU363164）与Bacillus sonorensis NB RC101234T（登录号：AYTN010000）的相似度高达99.85％，将该菌命名为Bacillus sp.YH-7；菌株YH-8（登录号：KU363162）则与Zhihengliuella halotolerans YIM70185T（登录号：DQ372937）的相似性最高（99.91%），将该菌命名为Zhihengliuella sp.YH-8；而菌株YH6-1则与Bacillus flexus IFO15715T（登录号：AB021185）的相似度最高（99.93%），则将该菌株命名为Bacillus sp.YH6-1；
　　（2）通过对菌株Bacillus sp.YH6-1的研究发现，该菌株同时产生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。以该菌（YH6-1）做为研究对象，发现它可以在0.5%-13%的氯化钠浓度范围下进行生长，其蛋白酶活力在0.5%氯化钠时，最高为3726.732 U/ml；在13%氯化钠时仍有一定的酶活力，活力值1471.765 U/ml约为0.5%氯化钠时的39.5%。
　　（3）对菌株Bacillus sp.YH6-1的产淀粉酶能力进行单因素分析。结果表明：菌株Bacillus sp.YH6-1产淀粉酶条件是接种量达到8%时，酶活力基本达到最高，达到了29.133 U/ml；温度是在30℃时酶活力基本达到最高值28.05 U/ml；pH达到8.5时，菌体产淀粉酶的能力最高；
　　（4）对菌株Bacillus sp.YH6-1的产脂肪酶能力进行单因素分析。结果表明：菌株Bacillus sp.YH6-1产脂肪酶条件是接种量达到8%时，酶活力基本达到最高，达到了4.09 U/ml；温度是在35℃时酶活力基本达到最高值4.56 U/ml；pH达到7.5时，菌体产脂肪酶的能力最高值3.83 U/ml；
　　（5）对菌株Bacillus sp.YH6-1的产蛋白酶能力进行单因素分析。结果表明：菌株Bacillus sp.YH6-1产蛋白酶条件是接种量达到10%时，酶活力基本达到最高，达到了3330.624 U/ml；温度是在35℃时，酶活力基本达到最高值3413.354 U/ml；pH达到8.5时，菌体产蛋白酶的能力最高值3996.49 U/ml；
　　（6）研究了碳源、氮源和无机盐离子对菌株Bacillus sp.YH6-1产蛋白酶能力的影响，结果表明使用牛肉膏为碳源时蛋白酶活力最高，可达到3469.21 Um/L；使用酵母膏为氮源时蛋白酶活力最高达到了4624.86 U/ml；离子的添加为 MgSO4时酶活力达到了4444.56 U/ml。
　　（7）通过响应面软件分析得到：当pH为8.63，牛肉膏浓度为1.16%，镁离子添加量为0.42%时，菌株Bacillus sp.YH6-1蛋白酶活力最高为4428.75 U/mL。

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1 前言

1.1中度嗜盐菌

1.2 盐湖

1.3 产功能酶的微生物

1.4细菌16S rRNA及其系统发育分析

1.5 研究现状

1.6 研究内容

1.7 本课题研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1产淀粉酶菌株YH-7的分离筛选及鉴定

3.2 产脂肪酶菌株YH-8的分离筛选及鉴定

3.3 产多功能酶菌株YH6-1的分离筛选及发酵条件优化

4 讨论

5 全文结论

致谢

参考文献

附录A