棉花轮纹斑病接种方法的优化及MAPK在抗轮纹斑病中作用的研究

摘要

链格孢菌（Alternaria alternata）引起的棉花轮纹斑病又叫做黑斑病（Alternaria leaf spot, Black leaf spot），可在棉花整个生长周期危害棉花叶片，且分布范围十分广泛、危害特别重、极易爆发流行，甚至形成毁灭性危害。一直以来，棉花轮纹斑病的人工接种十分困难，主要原因是其致病菌链格孢的孢子萌发条件苛刻，且很难侵染正常生长的棉花叶片，一般在有伤口时才能侵入。前期本实验室在对棉花轮纹斑病抗性机理的研究过程中，主要采用涂抹法接种，并进行套袋保湿处理，使棉株成功发病。但套袋条件下，叶片所处环境通风条件不佳，所形成的叶斑不能排除是其他霉菌所致，且涂抹叶片工作量大，伤叶不均匀，致使实验条件一致性较差。因此，本文对棉花轮纹斑病的接种方法进行进一步优化，得到如下结果：
　　1、无论是采用涂抹法还是喷雾法接种A. alternata，如果后期对棉苗不进行喷雾保湿处理，棉苗均不能正常发病。其中涂抹法接种不保湿处理，棉叶病斑便只能停留在浅绿色水渍状阶段，病原菌孢子不能正常萌发，病斑不继续发展为黑色轮纹状；而喷雾法不保湿处理，棉叶没有明显的病斑产生，几乎不能发病。
　　2、对棉苗进行喷雾保湿处理，涂抹法与喷雾法接种棉叶，均可使其成功发病。其中涂抹法接种的叶片病斑面积普遍较大，病情较重；而喷雾法接种的棉叶病斑呈黑色小圆点状，零星分布，逐渐由叶边缘向内发展，更接近田间发病症状，且实验的一致性较好，是一种较好的轮纹斑病接种方法。
　　3、涂抹法与喷雾法在喷雾保湿条件下，均可有效区分棉花感病品种新陆早7号、新陆早13号和抗病品种中植棉KV3、新陆早33号。
　　本研究中还采用VIGS(virus induced gene silencing)技术，研究MAPK基因在棉花抗轮纹斑病中的功能和作用，且同时采用两种不同接种方法接种，进行对比试验。得到如下结果：
　　1、成功沉默了编码 MAPK的基因：ADI52623.1G.hirsutum、Gorai.5g011100.1、ADI52622.1G.hirsutum、Gorai.7g050000.1、ABA00652.1G.hirsutum、ADI52627.1G.hirsutum、A_07602、Gorai.1g158800.1、AET36534.1G.hirsutm。
　　2、采用两种方法对9个MAPK基因进行棉花抗轮纹斑病的筛选，两种接种方法所筛选基因的抗病性结果基本相符，结果均显示基因 ADI52623.1G.hirsutum、Gorai.5g011100.1、ADI52622.1G.hirsutum、Gorai.7g050000.1沉默后，与对照相比，病情无明显差异，表明棉花对轮纹斑病的抗性并未受到明显的影响；而基因ABA00652.1G.hirsutum、ADI52627.1G.hirsutum、A_07602、Gorai.1g158800.1、AET36534.1G. hirsutm沉默后，与对照相比较，病情均有所加重，说明这5个MAPK基因可能参与调控棉花抗轮纹斑病过程中涉及到的信号通路，并在其中起非常重要的作用。
　　本研究首先实现了对棉花轮纹斑病接种方法的优化，且可以采用该接种方法对棉花抗病机制进行进一步研究；其次，证明了在 MAPK的相关基因中，存在可以调控棉花抗轮纹斑病性的基因，但本文所选取的 MAPK基因有限，不能作为充分的证据说明问题，随着棉花全基因组测序的完成，可以继续对MAPKs信号通路中全部相关基因进行筛选，从而更加全面的对MAPK在棉花抗轮纹斑病中的作用进行研究。

目录

1 绪论

1.1 棉花轮纹斑病的危害

1.1.1 棉花轮纹斑病的症状

1.1.2 棉花轮纹斑病的形成

1.1.3 棉花轮纹斑病接种方法

1.2 棉花轮文斑病病原菌

1.2.1 链格孢菌的分类研究历史

1.2.2 链格孢对主要农作物的危害情况

1.2.3 链格孢菌毒素

1.2.4 链格孢病害的防控策略

1.3 MAPK级联系统

1.3.1 MAPK级联信号通路的结构组成

1.3.2 MAPK级联信号通路的作用

1.3.3 植物的防御系统

1.4 病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silence，VIGS）

1.4.1 VIGS技术的原理

1.4.2 VIGS技术的建立发展及应用

1.5 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 试剂与仪器

2.2.1材料的培养

2.2.2培养基的制备

2.2.3病原菌培养

2.2.4接种物的制备

2.2.5病原菌接种方法

2.2.6试验组设置

2.2.7子叶注射农杆菌接种

2.2.8病害调查和统计

2.2.9对目的基因转录水平的检测—qRT-PCR

3 结果与分析

3.1不同接种方法的比较

3.1.1不同接种方法棉花轮纹斑病的发病情况比较

3.1.2不同接种方法发病时间的比较

3.1.3不同接种方法病斑比较

3.2两种接种方法鉴定不同棉花品种

3.3 MAPK基因沉默效率的检测结果

3.4 棉花MAPK基因对轮纹斑病抗性的影响

4 小结与讨论

参考文献

在学期间的研究成果

致谢