蜡蚧轮枝菌入侵蚧虫过程中胞外酶作用及提高酶活性的研究

摘要

蚧虫属昆虫纲Insecta半翅目Hemiptera蚧总科Coccoidea，全世界记录25科，7355种，绝大多数是农林、果树和花卉的重要害虫。蚧虫最大的特点是体壁具有多种泌蜡腺体，分泌大量蜡质，对虫体起保护作用，化学防治困难。开展生物防治是控制蚧虫的重要途径，包括应用天敌昆虫和病原微生物。利用病原微生物防治害虫具有可以人工扩大培养菌种，制成生物制剂，进行大面积应用，不污染环境等优点。蜡蚧轮枝菌Verticillium lecanii(Zimm.)是一种虫生真菌，最早由Nivter发现寄生咖啡蜡蚧(Lecanii coffeae)，然而目前主要用于防治粉虱和蚜虫，防治蚧虫的报道却极少。本研究采用从蚧虫和稻褐飞虱上分离出的蜡蚧轮枝菌两菌株（No.V3.4504（来自蚧虫）和No.V3.4505（来自稻褐飞虱））侵染蚧虫，分析了入侵过程中蜡蚧轮枝菌蛋白质酶和几丁质酶的作用机制;根据胞外酶的变化特点，比较了该菌对朝鲜毛球蚧、沙里院褐球蚧和日本龟蜡蚧侵染力的大小;研究了蚧虫蜜露的化学成分及其对蜡蚧轮枝菌入侵蚧虫的影响，并探讨了在培养基中加入蚧虫表皮和氨基酸对蜡蚧轮枝菌蛋白酶活性的调节作用。为利用蜡蚧轮枝菌防治蚧虫提供科学依据。
　　具体研究内容和结果如下:
　　1.蜡蚧轮枝菌对蚧虫的感染和两种胞外酶的作用采用从蚧虫和稻褐飞虱上分离出的病原蜡蚧轮枝菌两菌株为材料，用孢子悬浮液（浓度5×107孢子/mL）感染沙里院褐球蚧雌成虫，对染菌后虫体罹病症状观察发现，从染菌到蚧虫死亡大约经历7天，染菌后第2天在虫体表面蜡粉稀薄的位置开始出现菌丝，5天后，蚧虫表面菌丝大量生长，且交织在一起，虫体表皮开始出现褶皱，收缩变小，7天后，菌丝层加厚，虫体表皮萎缩，开始死亡。同时发现，虫体腹面贴于树皮，湿度比背面的大，孢子在体缘和腹面容易附着和萌发，在这两个部位的菌丝比背面的多。通过显微切片观察，在该蚧虫体壁的外表皮、内表皮和真皮层都发现了入侵的菌丝，说明该菌已侵染成功。
　　以沙里院褐球蚧雌成虫表皮制备成培养基，培养蜡蚧轮枝菌两菌株No.V3.4504和No.V3.4505，分别测定在培养过程中第1-8d两菌株的蛋白酶与几丁质酶活性的变化。结果发现，菌株No.V3.4504的蛋白酶活性在前6天连续上升，最大值为33.94±1.61U/g，然后降低;几丁质酶活性在前期维持在一个较低水平，第5天开始增加，最大值为7.28±1.36U/g。菌株No.V3.4505的蛋白酶和几丁质酶的活性变化趋势与No.V3.4504相似。说明蛋白酶在菌丝侵染体壁的前期发挥作用，降解表皮中的蛋白质，使几丁质暴露，诱导几丁质酶的大量产生，分解几丁质。
　　2.蜡蚧轮枝菌对三种蚧虫侵染力大小的研究用朝鲜毛球蚧、沙里院褐球蚧和日本龟蜡蚧的表皮为培养基，培养蜡蚧轮枝菌菌株No.V3.4504，测定了其蛋白酶和几丁质酶的活性。结果发现:以朝鲜毛球蚧表皮为培养基，菌的蛋白酶活在第1天为18.97±1.59U/g，沙里院褐球蚧表皮培养基的酶活为15.25±0.92U/g，它们的酶活都在第6天达到最大值，分别为34.58±1.01U/g和33.94±1.61U/g。但在日本龟蜡蚧表皮培养基上，其酶活的变化与前两者不同，第1天仅为7.67±0.62U/g，然后持续增高至第7天，酶活性出现最大值34.30±0.48U/g，比前两者推后了1天。朝鲜毛球蚧表皮培养基上菌的几丁质酶活性在第1天为7.23±0.67U/g，沙里院褐球蚧表皮培养基的几丁质酶活性仅为0.89±0.18U/g，而日本龟蜡蚧表皮培养基，几丁质酶活几乎测不出来;在后续7天的培养中，以朝鲜毛球蚧表皮上培养的菌的几丁质酶活远远高于其他两种。
　　对三种蚧虫表皮的成分分析结果显示，在每2.5g表皮中朝鲜毛球蚧、沙里院褐球蚧和日本龟蜡蚧的蛋白质含量分别是2.0 g、2.1g和1.8g，几丁质的含量分别为0.2g、0.1g和0.1g。这说明蛋白酶和几丁质酶的活性与蚧虫表皮中蛋白质和几丁质的含量成正比。根据这两种胞外酶的活性，认为菌株No.V3.4504侵染三种蚧虫的能力顺序是朝鲜毛球蚧＞沙里院褐球蚧＞日本龟蜡蚧。
　　3.蚧虫蜜露对蜡蚧轮枝菌入侵的影响针对蚧虫取食过程中从肛门排泄蜜露的习性，对苹果树上沙里院褐球蚧排泄蜜露的特点作了观察，采用化学分析和氨基酸自动分析仪测定了该蚧虫蜜露的化学成份，结果发现:蜜露组分中可溶性糖占69％，水分占26％，并含有18种氨基酸。将蜜露稀释为10％、20％、30％、40％、50％共5个浓度，培养蜡蚧轮枝菌两菌株，测定了它们的胞外蛋白酶和几丁质酶的活性。结果显示，菌株No.V3.4504的蛋白酶活性在蜜露浓度为10％时有最大值，为4.45±0.18U/mL，然后随着蜜露浓度增加，蛋白酶活性呈下降趋势;而菌株No.V3.4505的蛋白酶活性在蜜露浓度为20％时出现最大值，为8.5±0.71U/mL，随后，蛋白酶活性持续降低。
　　两菌株No.V3.4504和No.V3.4505的几丁质酶的活性变化趋势相同，都在蜜露浓度为10％时出现最大值，前者为0.144±0.012U/mL，后者为0.431±0.042U/mL，随后其活性都随蜜露浓度增加而降低。
　　上述结果说明两个问题，蜜露中高浓度糖对蛋白酶和几丁质酶的活性有抑制作用，因此在蚧虫分泌蜜露前期应用蜡蚧轮枝菌会有好的效果;两个菌株比较，菌株No.V3.4505更能适应在蜜露上生存。
　　4.蜡蚧轮枝菌蛋白酶活性调节试验比较了基本培养基和加入蚧虫表皮的培养基对蜡蚧轮枝菌的蛋白酶活性的影响，发现培养基中加入蚧虫表皮能提高蛋白酶的活性，菌株No.V3.4504增长幅度在2倍-12倍之间，菌株No.V3.4505增长幅度在2倍-3倍之间。
　　同时试验了培养基中分别加入氨基酸Ala、Met、Gly、 Pro对蜡蚧轮枝菌两菌株的蛋白酶活性的影响，结果发现:加入Met对蛋白酶的活性有提高作用，其中菌株No.V3.4504的增长了256.9％，菌株No.V3.4505增长了215.7％。
　　通过在液体培养基中加入不同量Met，培养菌株No.V3.4504，发现Met在0.25％和0.5％两个浓度下对该菌的蛋白酶的活性有极显著促进作用。说明Met作为调节剂，有一定的浓度要求。为扩大培养提高蛋白酶活性提供依据。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 蚧虫的危害及生物防治前景展望

1．2 虫生真菌对寄主昆虫的侵染过程和致病机理

1．3 蜡蚧轮枝菌的研究概况

1．4 本研究的内容、目的与意义

第二章 蜡蚧轮枝菌入侵蚧虫表皮过程中蛋白酶和几丁质酶的作用

2．1 材料和方法

2．1．1 菌种与虫种

2．1．2 试剂与仪器

2．1．3 菌种分生孢子悬浮液的制备

2．1．4 蚧虫染菌与症状观察

2．1．5 蚧虫体壁的石蜡切片制备与观察

2．1．6 菌种在蚧虫表皮培养基上的培养和酶液的制备

2．1．7 蛋白酶和几丁质酶的活性测定

2．1．8 三种蚧虫表皮脂肪、蛋白质和几丁质含量的测定

2．2 结果与分析

2．2．1 蜡蚧轮枝菌感染沙里院褐球蚧的外观症状

2．2．2 沙里院褐球蚧表皮结构及菌丝的入侵过程

2．2．3 蜡蚧轮枝菌侵染蚧虫体壁过程中蛋白酶与几丁质酶活性的变化趋势

2．2．4 蜡蚧轮枝菌两菌株胞外蛋白酶的活性比较

2．2．5 蜡蚧轮枝菌两菌株几丁质酶的活性比较

2．2．6 蜡蚧轮枝菌侵染三种蚧虫表皮过程中蛋白酶活性的变化

2．2．7 蜡蚧轮枝菌侵染三种蚧虫表皮过程中几丁质酶活性的变化

2．2．8 蜡蚧轮枝菌对三种蚧虫的侵染力与蚧虫表皮化学成分的关系

2．3 讨论

第三章 蜜露对蜡蚧轮枝菌入侵的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 菌种和蜜露

3．1．2 试剂与仪器

3．1．3 蜜露组分的分析

3．1．4 菌种分生孢子悬浮液的制备

3．1．5 菌种在蜜露培养基上的培养和酶液的制备

3．1．6 蛋白酶和几丁质酶的活性测定

3．2 结果与分析

3．2．1 沙里院褐球蚧排泄蜜露观察

3．2．2 沙里院褐球蚧蜜露组分的分析

3．2．3 蜜露对蜡蚧轮枝菌蛋白酶与几丁质酶活性的影响

3．3 讨论

第四章 蜡蚧轮枝菌蛋白酶的调节

4．1 材料与方法

4．1．1 菌种与虫种

4．1．2 培养基和酶液的制备

4．1．3 蛋白酶的活性测定

4．2 结果与分析

4．2．1 不同培养基的两个菌株蛋白酶活性的比较

4．2．2 不同氨基酸对蜡蚧轮枝菌蛋白酶活性的影响

4．2．3 不同浓度甲硫氨酸(Met)对蜡蚧轮枝菌蛋白酶活性的影响

4．3 讨论

第五章 总结

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

致谢

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