冬枣采后病害拮抗菌的筛选、发酵及活性物质研究

摘要

本文以冬枣病害研究中常见的病原菌细交链格孢、多隔镰孢霉和串珠霉为靶标，从森林和菜园土壤中筛选防治三种病原菌的拮抗菌。通过测定对不同病原菌的拮抗能力，确定拮抗菌的抑菌谱，从中筛选具有研究和开发价值的拮抗菌研究。对具有较好拮抗作用和较宽抑菌谱的拮抗菌B26确定其分类学地位;通过正交试验和单因子实验，研究B26产生拮抗物质的最优条件;并进一步研究拮抗菌粗蛋白对温度、酸碱度、紫外线照射、有机溶剂、蛋白酶的稳定性，结果如下:
　　从土壤中分离筛选出的11株对细交链格孢、多隔镰孢霉和串珠霉具有较好抑制作用的拮抗菌。平板对峙实验结果表明:B26的抑菌效果最显著，对细交链格孢的平均抑菌圈半径为15.8 mm，抑制率达78.8％;对多隔镰孢霉和串珠霉的平均抑菌圈半径分别为14.3 mm和12.8 mm，抑制率分别为71.3％和63.8％，具有进一步研究的价值。通过观察在PDA培养基上生长的形态学特征、结合生理生化实验以及PCR产物测序结果，鉴定B26为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
　　通过正交试验设计对培养基成分及用量进行优化，单因子实验对B26产生活性物质的发酵条件进行选择。B26在种子培养基扩大培养后接入不同成分的发酵培养基，获得产生拮抗效果最好的培养基成分的用量是:蛋白胨25 g，淀粉40 g，氯化钠1.5 g，硫酸铵0.8 g，磷酸氢二钾1.5 g;产生活性物质的最优发酵条件为:种子菌龄24 h，接种量5％，初始pH7，装液量20％，吐温80用量0.5％，发酵温度为30℃，转速150rpm，发酵时间为60 h，获得B26菌株发酵液对多隔镰孢霉的抑制直径为26mm，大于其他条件培养获得的拮抗菌直径。
　　枯草芽孢杆菌B26发酵液在4℃，经8000rpm，离心20 min后，过0.45μm微孔滤膜后，用70％的硫酸铵沉淀，透析后获得仍具有拮抗细交链格孢、多隔镰孢霉和串珠霉活性的无菌粗蛋白。进一步通过实验检测粗蛋白对温度、酸碱度、紫外线照射、有机溶剂和蛋白酶处理的稳定性，结果表明:B26的粗蛋白经100℃，20 min处理后，仍是常温处理下抑菌直径的78.2％，对高温具有一定的耐受性;但经121℃，20 min处理后，B26粗蛋白完全失去活性;粗蛋白在pH3-pH10范围内都具有抑菌活性，具有较宽的pH适应范围，但在pH为7时抑菌能力最高，所以应注意B26抑菌蛋白的纯化应在偏中性的条件下进行;粗蛋白对紫外线照射有部分敏感性，B26的抑菌粗蛋白经距离40 cm，20W紫外灯照射80 min后，抑菌活性是对照的78.1％;有机溶剂对枯草芽孢杆菌B26的抑菌粗蛋白的抑菌活性影响很小，经过乙醚，甲醇，氯仿，和丙酮有机溶剂处理过的粗蛋白的抑菌活性分别为对照的96.4％、85.7％、82.1％、81.5％;B26的抑菌粗蛋白对三种蛋白酶具有部分敏感性，B26的抑菌粗蛋白经过蛋白酶K处理后，拮抗直径活性为15.2 mm，为对照的76.7％，经过胰蛋白酶处理的拮抗直径为16.2 mm，是未处理的81.8％，而经过胃蛋白酶处理过的，拮抗直径为16.3 mm，抑制率是未处理的83.3％。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 冬枣及其主要病害

1．1．1 冬枣营养价值

1．1．2 冬枣主要病害

1．2 果实采后病害的防治措施

1．2．1 物理措施

1．2．2 化学方法

1．2．3 生物防治

1．3 果实采后生物防治的研究进展

1．3．1 果实采后病害的生物防治的概念

1．3．2 理想拮抗菌的特点

1．3．3 拮抗菌的筛选途径

1．3．4 拮抗菌产生活性物质的种类

1．3．5 拮抗菌防治病害的机制

1．4 拮抗菌在生物防治研究中存在的主要问题和发展方向

1．4．1 拮抗菌研究及商业化中存在的主要问题

1．4．2 发展方向

1．5 本研究的目的和意义

第二章 采后病害拮抗菌的筛选和鉴定

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 供试材料与培养基

2．2．2 方法

2．3 结果与分析

2．3．1 抗菌的分离筛选

2．3．2 拮抗菌B26的抑菌谱

2．3．3 拮抗菌的形态学观察和革兰氏染色

2．3．4 琼脂糖凝胶电泳

2．3．5 菌株的系统发育

2．4、小结

第三章 拮抗菌培养条件研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．3 结果与分析

3．3．1 正交试验结果

3．3．2 培养条件

3．4 小结

第四章 拮抗菌活性成分稳定性的研究

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 材料

4．2．2 方法

4．3 结果与分析

4．3．1 最佳硫酸铵沉淀浓度确定

4．3．2 温度稳定性测定

4．3．3 对pH的稳定性

4．3．4 紫外灯照射后稳定性

4．3．5 有机溶剂稳定性测定

4．3．6 对蛋白酶的稳定性

4．4 小结

第五章 结论

参考文献

附图

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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