SO2诱导蚕豆气孔运动与保卫细胞死亡效应研究

摘要

二氧化硫（sulfurdioxide，SO2）作为常见的大气污染物，对生物的危害主要是通过其进入生物体内产生的亚硫酸根与亚硫酸氢根对组织、细胞和生物大分子的作用而实现的。SO2能影响气孔运动，阻碍气孔的正常开闭，影响植物的生理活动。高浓度的SO2能造成植物叶片失绿或坏死，抑制细胞分裂，诱导微核形成，导致部分细胞死亡。但SO2如何影响气孔运动及诱导细胞死亡，以及这些过程中涉及到的调控机制，尚未见报道。
　　植物叶表面的气孔保卫细胞是研究信号转导的模式实验系统，对环境变化反应灵敏而准确。本文采用蚕豆叶面气孔保卫细胞，研究SO2衍生物(Na2SO3-NaHSO3混合液，3∶1，mmol·L-1)对气孔运动和保卫细胞死亡的影响。研究发现，低浓度的SO2胁迫可导致气孔关闭，活性氧和Ca2+参与了SO2诱导的气孔关闭;高浓度的SO2胁迫可导致保卫细胞活性降低或死亡，活性氧、Ca2+及类caspase蛋白酶参与了SO2诱导的细胞死亡，并发挥了重要作用。主要实验结果如下:
　　在浓度7.5～150μmol·L-1内，SO2衍生物处理表皮条3h可使气孔开度明显减小。0.1μmol·L-1、1μmol·L-1和10μmol·L-1的外源H2O2或10μmol·L-1、100μmol·L-1和200μmol·L-1的CaCl2可诱导气孔开度减小。用1mmol·L-1抗氧化剂抗坏血酸或0.1mmol·L-1Ca2+通道抑制剂LaCl3与150μmol·L-1的SO2衍生物共同作用时，气孔开度显著增加。0.1mmol·L-1LaCl3能缓解10μmol·L-1的H2O2诱导的气孔开度减小。
　　在浓度1～4mmol·L-1内，SO2衍生物处理表皮条3h可使表皮保卫细胞活性降低，部分细胞死亡;随着处理浓度的提高细胞死亡率增高。利用活性氧(ROS)荧光指示剂DCFH-DA和Ca2+荧光指示剂Fluo-3AM检测胞内ROS和Ca2+水平发现，SO2衍生物处理可致保卫细胞内ROS和Ca2+水平升高，SO2与LaCl3共同作用时胞内ROS荧光信号强度与SO2单独作用组无明显差异，而SO2与抗坏血酸共同作用时胞内Ca2+荧光信号强度明显弱于SO2单独作用组。一定浓度的抗坏血酸(0.1mmol·L-1，1mmol·L-1)或过氧化氢酶(200U·mL-1)与SO2衍生物共同作用时，胞内ROS水平降低，细胞死亡率下降。Ca2+螯合剂乙二醇双四乙酸(0.1mmol·L-1，1mmol·L-1)或Ca2+通道抑制剂LaCl3（0.1mmol·L-1）与SO2衍生物共同作用时，胞内Ca2+水平与细胞死亡率降低。0.1mmol·L-1LaCl3能降低外源H2O2(40mmol·L-1)诱导的细胞死亡率。
　　表皮条经2～3mmol·L-1的SO2衍生物处理3h后，分别用PI和Schiff试剂染色，均可观察到死细胞中典型的核凋亡特征，如核固缩、核降解和凋亡小体。用0.1μmol·L-1或0.5μmol·L-1泛caspase蛋白酶抑制剂Z-Asp-CH2-DCB或0.1μmol·L-1丝氨酸蛋白酶抑制剂TLCK与SO2衍生物同时作用，能明显抑制SO2衍生物诱导的细胞死亡。
　　研究结果表明，低浓度的SO2可诱导蚕豆气孔关闭，胁迫期间胞内ROS和Ca2+水平的升高在气孔运动调节中发挥了重要作用。SO2胁迫使气孔保卫细胞内ROS生成过量，ROS激活质膜Ca2+通道，使胞外Ca2+内流，造成胞内Ca2+浓度升高，继而介导一系列的信号反应调节气孔开度。高浓度的SO2暴露可诱导蚕豆气孔保卫细胞死亡，这一过程与胞内ROS爆发有关，ROS能激活质膜Ca2+通道，使胞外Ca2+内流，造成胞内Ca2+浓度大幅升高，介导细胞死亡。SO2处理组蚕豆气孔保卫细胞中可见典型的核凋亡特征，且caspase蛋白酶抑制剂可显著降低SO2引发的细胞死亡率，说明SO2暴露诱导的细胞死亡途径中有部分细胞发生了程序性的死亡，在叶片保卫细胞中可能存在类caspase蛋白酶活性，参与了细胞的凋亡过程。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 SO2污染概况

1．1．1 SO2污染现状

1．1．2 SO2对植物的损伤

1．2 气孔运动概述

1．3 活性氧在气孔运动和细胞死亡中的作用

1．3．1 ROS对气孔运动的影响

1．3．2 ROS对细胞死亡的影响

1．4 Ca2+在气孔运动和细胞死亡中的作用

1．4．1 Ca2+对气孔运动的影响

1．4．2 Ca2+对细胞死亡的影响

1．5 细胞凋亡

1．5．1 细胞凋亡与逆境胁迫

1．5．2 caspase蛋白酶在植物细胞凋亡中的作用

第二章 SO2诱导蚕豆气孔运动

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 主要试剂

2．2．2 主要实验仪器

2．2．3 植株培养

2．2．4 表皮条的剥离

2．2．5 保卫细胞活性检测

2．2．6 气孔开度测量

2．2．7 统计分析

2．3 结果与分析

2．3．1 SO2对蚕豆气孔运动的影响

2．3．2 ROS在SO2诱导蚕豆气孔运动中的作用

2．3．3 Ca2+在SO2诱导蚕豆气孔运动中的作用

2．3．4 LaCl3对H2O2诱导蚕豆气孔运动的影响

2．4 讨论

第三章 SO2诱导蚕豆气孔保卫细胞死亡

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 主要试剂及实验仪器

3．2．2 植株培养

3．2．3 表皮条的剥离

3．2．4 药物处理

3．2．5 细胞活性检测

3．2．6 胞内ROS水平检测

3．2．7 胞内Ca2+水平检测

3．2．8 凋亡特征观察

3．2．9 统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 SO2对蚕豆保卫细胞的致死效应

3．3．2 ROS在SO2致保卫细胞死亡中的作用

3．3．3 Ca2+在SO2诱导保卫细胞死亡中的作用

3．3．4 LaCl3对Ca2+与H2O2致蚕豆保卫细胞死亡的缓解作用

3．3．5 SO2诱导蚕豆保卫细胞凋亡

3．4 讨论

图版

结论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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