利什曼原虫的流行病学调查及基因分型研究

摘要

黑热病又称内脏利什曼病,是由杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)引起、经白蛉叮咬传播的慢性地方性传染病。此病是一种严重危害人类生命和健康的人兽共患寄生虫病,世界流行,主要分布在中国、印度北部和中东地区,是世界卫生组织的重要目标疾病之一。
　　 最近六年,黑热病在西部六省(新疆、甘肃、内蒙、陕西、山西和四川)呈散发态势,每年新发生的病例数大致在400例左右,其中新疆、甘肃和四川的发病患者数占全国新发患者的90％以上,且有向非流行区扩散的趋势。尤其是08年汶川地震后,大量无主犬四处流浪,成为新的传染源。08年病人数为9例,09年上半年就出现6例病人。同年,喀什市伽师县出现了荒漠源型黑热病的暴发流行,给当地人民的身体健康造成了极大危害。因此,掌握疫区无症状家犬的数量并及时了解该地区人群利什曼原虫感染现状具有重要意义。
　　 在我国,黑热病分平原型、山丘型和荒漠源型三个不同的流行区。而且三个疫区的黑热病在流行病学上存在着显著差异,而病原体形态又难以区别,亟待在分子水平揭示我国利什曼原虫种株间的差异,这对黑热病的防治而言具有不言而喻的重要性。
　　 本次实验我们选用的基因靶点为利什曼原虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)和利什曼原虫核糖体DNA(rDNA)ITS区段。
　　 根据kDNA保守区合成引物RV1、RV2和K13A、K13B,对培养的不同地区的利什曼原虫进行PCR,成功扩增出了利什曼原虫保守片段。从而证明两对引物同时应用可以用于利什曼原虫的虫种鉴定。
　　 本研究组赴新疆喀什采得病人、病人家属和邻居血样75份,赴四川黑水县采得家犬血样106份。每份分别包括抗凝血和非抗凝血,经血样PCR和血清ELISA得出了新疆喀什地区易感人群利什曼原虫感染率为69.33％;四川黑水县目前的家犬黑热病感染率为19.05％。说明新疆喀什和四川黑水县仍然有较高的利什曼原虫感染率。同时,设计了黑热病调查表对新疆喀什的采血对象进行了问卷调查,经统计学软件SPSS进行Logistic回归分析显示,户外被叮咬和邻居或家属中有黑热病患者是感染黑热病的危险因素,家庭成员或邻居中有黑热病患者为主要传染因素,新疆喀什地区的黑热病有较显著的家庭聚集现象。
　　 对我国三种疫区的四个地方的杜氏利什曼原虫分离株即山东分离株、四川分离株、新疆分离株和伽师县分离株的ITS-1进行PCR扩增,并进行测序工作,获得了3个我国不同疫区的DNA序列,并进行了比较分析,证明山东、四川、新疆和伽师县分离株虫体ITS-1序列之间存在不同程度的变异,其中伽师县分离株虫体的ITS-1突变最为频繁,序列多态性现象最为显著。研究中还构建了利什曼原虫系统进化树,显示三个疫区利什曼原虫分离株在同源程度上存在明显差异。荒漠分离株与平原分离株及山丘分离株距离较远,平原分离株与山丘分离株之间的距离相对略近一些,荒漠分离株与山丘分离株的同源性略低于荒漠分离株与平原分离株的同源性,说明黑热病的传播可以是通过媒介白蛉从野生动物宿主直接传给人,这与病人直接进入荒野感染有关。
　　 总之,本研究首先选定杜氏利什曼原虫动基体DNA(KinetoplastDNA)为PCR扩增的基因靶点,证实引物RV1、RV2和K13A、K13B可以用于利什曼原虫的虫种鉴定;对黑热病流行区四川黑水县的家犬血液样本和新疆喀什地区易感人群血液样本进行经PCR,检测其感染率,表明四川黑水县和新疆喀什地区黑热病感染现状仍然严峻;其次,对喀什地区进行了黑热病发生的危险因素分析,表明喀什市的黑热病具有家族聚集现象;这有益于使我们及时了解黑热病感染现状,为黑热病的防治提供流行病学方面的资料。通过对ITS1片段序列的分析,从基因水平进一步说明了我国荒漠疫区、山丘疫区、平原疫区利什曼原虫分离株之间存在的差异。从一定程度上解释了三个疫区黑热病在临床症状、药物治疗、流行病学等方面存在的不同,进一步揭示不同分离株之间的关系,从而在根本上为我国不同类型黑热病的防治提供了科学依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:主要符号表

研究生导师简介及课题指导小组简介

前言

第一部分 利什曼原虫的虫种鉴定

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 PCR结果

2.2 测序及比对结果

3 讨论

第二部分 四川省黑水县家犬利什曼原虫感染率的检测

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 PCR检测结果

2.2 ELISA检测结果

3 讨论

第三部分 新疆喀什地区人群利什曼原虫感染率的检测和黑热病发生的危险因素分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 PCR检测结果

2.2 ELISA检测结果

2.3 logistic回归分析

3 讨论

第四部分 我国不同疫区杜氏利什曼原虫ITS-1片段序列的多态性分析

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 PCR结果

2.2 测序结果与序列分析结果(测序彩图见附录)

3 讨论

结论

参考文献

附录

综述 我国黑热病的流行概况和防治现状*

攻读学位期间的研究成果

致谢