一株拟南芥敏感突变体的筛选及表型分析

摘要

重金属镉(Cd)毒性高，难降解，是对生物体有较强遗传毒性的物质。近年来，有关植物对重金属Cd胁迫响应的基因已有很多报道，这些基因主要有ZIP家族，HMA家族等。通过对这些基因的研究了解了一些植物应答重金属Cd胁迫过程中的自我保护机制，例如HMA家族基因对区室化的作用等。但是，植物应对Cd胁迫是一个复杂的过程，这其中涉及的应答机制相关研究尚不深入。
　　本研究通过优化拟南芥Cd敏感突变体筛选条件，从化学诱导激活型拟南芥T-DNA插入突变体库中筛选出一些具有Cd胁迫敏感表型的株系;将其中表型最明显的植株为命名为atcsr-2，作为本研究的材料。通过Tail-PCR鉴定表明该突变体的T-DNA插入位点为At2g36130(相应地称作AtCSR)。该基因能够编码一种肽酰-脯氨酰顺反式异构酶(Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase)，此酶能够降低蛋白质折叠过程中所需的能量，有助于蛋白质正确折叠。为了探究CSR基因位点突变在生理水平上对拟南芥应答Cd胁迫的影响，我们对根长、Cd含量累积量、叶绿素含量、MDA、H2O2、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等植物胁迫损伤重要指标进行了检测。通过对比Col-0和atcsr-2在Cd胁迫处理条件下这些指标的差异，发现atcsr-2突变体体内积累了大量的Cd2+、MDA、H2O2，受到了更加严重的自由基损伤。在确定atcsr-2突变体受到的氧化胁迫较野生型更为明显后，为进一步了解其相关的抗氧化机制，我们对比了两者在Cd胁迫条件下抗氧化酶活性和相关基因表达量变化以及Cd转运蛋白编码基因的表达情况。结果表明atcsr-2突变体中CAT、SOD、POD、APX等抗氧化酶活性均低野生型植株，其编码基因表达水平变化与酶活性变化趋势一致。而Cd的内转运蛋白编码基因IRT1表达量增高，Cd离子区室化转运蛋白MRP3的表达量降低，这导致细胞质中Cd离子累积，毒害增强。另外，我们将CSR构建到原核表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达，观察大肠杆菌在Cd胁迫条件下的耐受性变化，并且测定了SOD、CAT酶活性。结果表明诱导表达AtCSR的细菌对Cd的耐受性明显增强，抗氧化酶活性相应升高。本研究分别从表型水平、生理生化水平、分子水平等多个方面分析了atcsr-2突变体Cd敏感表型的原因，为进一步了解AtCSR响应重金属Cd胁迫的机制奠定基础。

目录

论文说明

摘要

第一章 综述

1．1 Cd对植物的毒害作用

1．1．1 Cd胁迫对植物生长发育的影响

1．1．2 Cd对植物光合作用的影响

1．1．3 Cd对植物渗透调节物质的影响

1．1．4 Cd对植物DNA及一些生物大分子结构的影响

1．2 植物对重金属胁迫的抗性机理

1．2．1 细胞的区室化作用

1．2．2 激活体内保护酶系统

1．2．3 形成重金属络合物

1．2．4 基因表达水平的调控

1．3 Tail-PCR技术在基因克隆中的应用

1．4 At2g36130基因功能的研究现状

1．5 本实验的研究目的和意义

第二章 筛选浓度的确定及突变体的筛选

2．1 材料和方法

2．1．1 实验材料和培养条件

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 筛选浓度的确定

2．2．2 纯合突变体的筛选

2．3 结果与分析

2．3．1 筛选浓度的确定

2．3．2 Cd敏感突变体的筛选

2．4 讨论

第三章 Cd敏感突变体atcsr-2的插入位点鉴定

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 实验方法

3．2 结果与分析

3．3 讨论

第四章 Cd胁迫对atcsr-2突变体生理生化、分子水平的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料和培养条件

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 测定方法

4．2 结果与分析

4．2．1 Cd对Col-0和atcsr-2叶绿素含量的影响

4．2．2 Cd对Col-0和atcsr-2体内Cd含量的影响

4．2．3 Cd对Col-0和atcsr-2氧化损失指标的影响

4．2．4 Cd胁迫对Col-0和atcsr-2体内渗透物质的影响(还原性糖／还原性蛋白／脯氨酸)

4．2．5 Cd胁迫对Col-0和atcsr-2体内相关金属离子转运蛋白编码基因表达的影响

4．3 讨论

第五章 Cd胁迫后抗氧化系统测定及抗氧化酶相关基因表达水平检测

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料和培养条件

5．1．2 实验试剂

5．1．3 实验仪器

5．1．4 实验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 Cd对Col-0和atcsr-2 GSH含量的影响

5．2．2 Cd对Col-0和atcsr-2 POD活性的影响

5．2．3 Cd对Col-0和atcsr-2 CAT活性的影响

5．2．4 Cd对Col-0和atcsr-2 APX活性的影响

5．2．5 Cd对Col-0和atcsr-2 SOD活性的影响

5．2．6 Cd胁迫下Col-0和atcsr-2抗氧化酶转录水平表达量的变化

5．3 讨论

第六章 ATCSR原核表达载体对Cd胁迫耐性的测定

6．1 材料与方法

6．1．1 实验材料

6．1．2 实验试剂和仪器

6．1．3 实验方法

6．2 结果与分析

6．2．1 诱导表达AtCSR大肠杆菌抑菌圈测定

6．2．2 诱导表达AtCSR大肠杆菌MDA含量测定

6．2．3 诱导表达AtCSR大肠杆菌抗氧化酶活性(CAT、SOD)测定

6．3 讨论

结论

参考文献

附录

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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