HL-60细胞诱导分化后VEGF表达变化的分子机制研究

摘要

背景：
　　 作为目前已知最重要的正性血管生成调节因子，血管内皮细胞生长因子(VEGF)可以刺激血管内皮细胞的增殖，增强血管的渗透性，有利于肿瘤的发生和转移。1971年Folkman首次提出肿瘤的血管生成(angiogenesis)这一观点。不久VEGF信号通路就被确定为抗肿瘤治疗的新靶点。人们对实体瘤中VEGF信号通路的研究比较深入，如细胞外信号调节激酶Raf/MEK/ERK信号通路，PI3K/AKT信号通路，p38MAPK信号通路，JNK/STAT信号通路，NF-κB信号通路，DLL4-Notch信号通路等。同样在白血病中也存在明显的血管新生现象，表现为骨髓微血管密度(MVD)的增高，并且伴有VEGF表达水平的升高。但是，白血病细胞VEGF表达分泌的机制，以及靶向VEGF调控在白血病细胞增殖分化中的作用至今没有明确。
　　 目的：
　　 基于上述理论背景，本研究建立ATRA诱导急性早幼粒白血病细胞株HL-60细胞分化的模型，在该细胞模型中VEGF表达水平下降，在此基础上进一步探讨VEGF表达调控的关键分子机制，从肿瘤相关基因的转录因子出发，检测其与VEGF表达的关联性，筛选出调控VEGF表达的上游转录因子，探索新的基因靶点，拟为白血病的治疗开辟新的治疗道路。
　　 方法：
　　 取对数生长期的HL-60细胞，加入lμMATRA，于37℃、5％CO2饱和湿度下培养96小时，Wright-Gimesa染色观察HL-60细胞形态，硝基四唑氮蓝(NBT)还原实验检测HL-60细胞分化，流式细胞术检测CDllb的表达和HL-60细胞周期，四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HL-60细胞增殖，免疫细胞化学法检测HL-60细胞VEGF、c-myc的表达，逆转录，聚合酶链反应(RT-PCR)检测CDllb、VEGF、HIF-1α、STAT3、c-myc、P53、VHL、COX-2、SP-1和AP-1mRNA的表达，蛋白质印记(Westemblot)检测细胞VEGF、STAT3、c-myc的蛋白表达。RNA干扰（RNAi）检测STAT3、c-myc与VEGF的关系，染色质免疫共沉淀(ChIP)进一步验证c-myc与VEGF启动子的结合情况。测定结果用x±s表示，均数比较采用f检验，组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学意义，P＜O.01为有显著性差异。
　　 结果：
　　 lμMATRA作用96小时可显著抑制HL-60细胞的增殖，并出现明显的分化现象，倒置显微镜下观察到细胞明显向成熟粒细胞方向分化；免疫细胞化学法显示VEGF表达量明显下降；流式细胞术检测细胞周期，处于G0/G1期的比例高达77.31％;流式细胞术检测细胞表面标记CDllb表达水平明显升高（P＜0.01）；NBT阳性率为82.59％(P＜0.01)；RT-PCR检测VHL基因表达无明显变化（p＞0.05），HIF-1α、P53、COX-2、SP-1和AP-1mRNA表达水平升高；RT-PCR及Westemblot检测VEGF、STAT3和c-mycmRNA和蛋白表达水平均明显下降(P＜0.05);RNAi结果显示阻断c-myc基因的表达，VEGF基因的表达水平明显下降(P＜0.05);ChIP实验进一步验证c-myc与VEGF启动子的结合情况。
　　 结论：
　　 在ATRA诱导HL-60细胞分化的模型中VEGF的表达水平随诱导分化的进程而下降，VEGF的下调可能与c-myc、STAT3具有显著相关性，而且c-myc可能结合于VEGF启动子区域，调控VEGF的表达。HIF-1α、P53、VHL、COX-2、SP-1和AP-1可能作为负调控因子参与VEGF的调控表达，也有可能在HL-60细胞分化的某些环节发挥更加重要的作用。

目录

研究生导师及课题小组成员简介

声明

主要符号表

前言

材料与方法

1．1 主要材料仪器

1．1．1 主要材料

1．1．2 主要仪器设备

1．2 细胞培养及诱导分化模型建立

1．2．1 MTT法测定HL-60细胞增殖

1．2．2 PI单染法FACS检测HL-60细胞周期

1．2．3 Wright-Gimesa染色观察HL-60细胞分化

1．2．4 NBT还原实验检测HL-60细胞分化

1．2．5 流式细胞术检测CD11b的表达

1．3 HL-60细胞分化模型中VEGF表达水平的检测

1．3．1 RT-PCR检测HL-60细胞VEGF mRNA的表达

1．3．2 Werstern blot检测HL-60细胞VEGF蛋白的表达

1．3．3 免疫细胞化学法检测HL-60细胞胞浆中VEGF的表达

1．4 VEGF上游传统转录因子HIF-1α、P53表达水平的检测

1．5 HL-60细胞分化模型中VEGF上游其它转录因子的初筛

1．6 HL-60细胞分化模型中VEGF上游转录因子的进一步筛选

1．6．1 Werstern blot检测HL-60细胞STAT3、c-myc蛋白的表达

1．6．2 RNAi检测HL-60细胞STAT3、c-myc与VEGF的调控关系

1．6．3 免疫细胞化学法检测HL-60细胞胞内c-myc的表达

1．6．4 ChIP鉴定c-myc与VEGF启动子的结合

1．7 统计学处理方法

结果

2．1 HL-60细胞分化指标的检测

2．1．1 ATRA抑制HL-60细胞增殖浓度的筛选

2．1．2 ATRA作用于HL-60细胞后细胞周期被阻滞于G0/G1期

2．1．3 Wright-Gimesa染色观察HL-60细胞分化现象

2．1．4 ATRA作用于HL-60细胞后NBT阳性率升高

2．1．5 ATRA作用于HL-60细胞后CD11b的表达水平升高

2．2 ATRA作用于HL-60细胞后VEGF的表达水平下降

2．2．1 RT-PCR显示ATRA作用于HL-60细胞后VEGF mRNA表达水平下降

2．2．2 Western blot显示ATRA作用于HL-60细胞后VEGF蛋白表达水平下降

2．2．3 免疫细胞化学法显示ATRA作用于HL-60细胞后胞浆内VEGF表达水平下降

2．3 HL-60细胞分化模型中VEGF上游传统转录因子HIF-1α、P53表达水平的变化

2．4 HL-60细胞分化模型中VEGF其它上游转录因子的初筛

2．5 HL-60细胞分化模型中上游转录因子的进一步筛选

2．5．1 Western blot显示ATRA作用于HL-60细胞后STAT3、c-myc蛋白表达水平下降

2．5．2 RNAi显示HL-60细胞中c-myc与VEGF表达趋势一致,STAT3与VEGF表达趋势不同

2．5．3 免疫细胞化学法显示ATRA作用于HL-60细胞后c-myc表达水平下降

2．5．4 ChIP显示c-myc结合于VEGF启动子上

讨论

结论

参考文献

综述

攻读硕士学位期间已(待)发表论文

致谢