AtLCD和AtDCD可增强大肠杆菌对Cd2+的耐受性

摘要

硫化氢(H2S)是继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)后发现的第三种气体信号分子，在动物中与后二者具有相似的作用，能调节动物体内重要的生理功能。在植物中这一分子的作用也逐渐被认识，但是关于植物体内产生H2S的关键酶基因的功能研究才刚刚起步，因此还需进一步研究。
　　 拟南芥L/D-半胱氨酸脱巯基酶（AtLCD和AtDCD）是其内源H2S产生的关键酶。本实验以拟南芥为研究材料，将AtLCD(At3g62130)和AtDCD(At1g48420)基因分别构建于原核表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，分析这两种蛋白是否会影响大肠杆菌对重金属Cd2+的耐受性。主要结果如下:
　　 1.诱导表达AtLCD和AtDCD蛋白具有相应的半胱氨酸脱巯基酶活性。经软件分析AtLCD的蛋白条带大小为46.4kDa;AtDCD的蛋白条带大小为41.7kDa（http://www.expasy.ch/tools）。IPTG诱导后SDS-PAGE电泳检测，在45kDa位置附近出现了预期蛋白条带。H2S产生速率检测的结果表明，BL21(LCD)蛋白提取物以L-半胱氨酸(Cys)为底物产生的H2S的速率比对照高了1.07倍;BL21(DCD)以D-Cys为底物产生的H2S速率比对照高了7.2倍。
　　 2.AtLCD和AtDCD可增强大肠杆菌对Cd2+的耐受性。在220μMCd2+胁迫条件下，存活率以菌落形成单位(CFU)的直径大于1mm为指标，结果显示菌株BL21(LCD)和BL21(DCD)存活率明显提高，是野生型(WT)BL21(DE3)的15.83倍和9.07倍;氧化损伤以丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量为指标，结果显示菌株BL21(LCD)和BL21(DCD)体内的MDA和H2O2含量显著降低;抗氧化酶系统以超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性为指标，结果显示菌株BL21(LCD)和BL21(DCD)体内的SOD和CAT活性显著降低;添加H2S的合成抑制剂氨水+丙酮酸钾（NH3+C3H3KO3，简称为NC）可部分抵消AtLCD和AtDCD的作用。
　　 3.H2S是大肠杆菌减轻氧化损伤、增强镉胁迫耐受性的原因。通过添加外源H2S的供体硫氢化钠(NaHS)处理野生型大肠杆菌BL21(DE3)，结果显示在220μMCd2+胁迫条件下，添加NaHS的野生型菌株BL21(DE3)存活率显著提高;同时添加NaHS和NC的存活率显著降低。

目录

论文说明

摘要

第一章 综述

1．1 硫化氢(H2S)生理调节功能的研究

1．1．1 气体信号分子H2S的物理化学性质

1．1．2 生物体内H2S的产生过程

1．1．3 H2S的生理功能

1．2 微生物对镉(Cd2+)胁迫的应答机理

1．2．1 Cd2+对微生物的毒害作用

1．2．2 微生物对Cd2+等重金属胁迫耐性的研究现状

1．3 本实验的研究目的和意义

第二章 重组蛋白AtLCD和AtDCD的表达及其功能研究

2．1 材料和方法

2．1．1 植物、菌株和载体

2．1．2 实验试剂和仪器

2．2 实验方法

2．2．1 原核表达载体的过程

2．2．2 SDS-PAGE电泳检测

2．2．3 蛋白AtLCD和AtDCD的纯化

2．2．4 蛋白AtLCD和AtDCD的酶活检测

2．3 结果与分析

2．3．1 PCR扩增目的基因AtLCD和AtDCD

2．3．2 载体pMD18-T-AtLCD和pMD18-T-AtDCD的构建及酶切检测

2．3．3 载体pET28a-AtLCD和pET28a-AtDCD的构建及酶切检测

2．3．4 AtLCD和AtDCD的SDS-PAGE电泳检测

2．3．5 AtLCD和AtDCD的纯化

2．3．6 AtLCD和AtDCD蛋白结构的生物信息学初步预测

2．3．7 BL21(LCD)和BL21(DCD)菌株H2S产生速率的检测

2．4 讨论

第三章 菌株BL21(LCD)和BL21(DCD)对Cd2+胁迫耐性的测定

3．1 材料和试剂

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂和仪器

3．2 实验方法

3．2．1 大肠杆菌的培养、处理及表型观察

3．2．2 Cd2+胁迫下大肠杆菌中H2O2和MDA含量的测定

3．2．3 Cd2+胁迫下大肠杆菌中SOD和CAT活性的测定

3．3 结果与分析

3．3．1 AtLCD和AtDCD对Cd2+胁迫下大肠杆菌生长的影响

3．3．2 AtLCD和AtDCD、NaHS对Cd2+胁迫下BL21(LCD)和BL21(DCD)菌株H2O2和MDA含量的影响

3．3．3 AtLCD和AtDCD、NaHS对Cd2+胁迫下BL21(LCD)和BL21(DCD)菌株CAT和SOD酶活的影响

3．3．4 NaHS对野生型大肠杆菌的生长影响

3．4 讨论

结论

参考文献

附录

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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