嗜热四膜虫内Ran结合蛋白1的功能分析

摘要

Ran蛋白(RanGTPase)属于小G蛋白家族，分子量约20～30kD，具有GTP水解酶活性。Ran蛋白与伴侣分子相互作用，可在Ran-GTP/GDP结合状态之间转变，进而执行不同的生理功能，可以调节染色体稳定性、纺锤体组装、细胞核组建以及核质运输等多种细胞进程。
　　 Ran结合蛋白1(Ran-bindingProtein1，RanBP1)是Ran蛋白的必要调控因子，含有保守Ran结合区RBD(Ran-bindingdomain)，可与Ran蛋白结合，促进Ran-GTP复合物的水解。哺乳动物细胞中的研究表明RanBP1蛋白在细胞核质运输、中心体的装配、微管的聚合、纺锤体的组装甚至细胞凋亡中都发挥着重要的作用。
　　 嗜热四膜虫（Tetrahymenathermophila）是一种单细胞的原生动物，存在有性生殖与无性生殖两种生殖模式，同时具有二倍体小核和多倍体大核两种细胞核，是研究细胞核动态变化的良好模式体系。嗜热四膜虫中Ran蛋白的功能研究表明其对大核的无丝分裂有重要的调控作用，异常的含量表达甚至会导致细胞发育停滞。目前尚未有研究探索嗜热四膜虫中Ran结合蛋白1的相关功能。
　　 本研究首次从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出一个保守的Ran结合蛋白，并对其序列特征、定位及其功能进行了分析，研究结果如下:
　　 1.RBP1基因的生物信息学分析RBP1(TTHERM_00158040)基因开放读框全长558bp，拟编码185个氨基酸，按照四膜虫体系规则将其编码蛋白命名为Rbp1p。相对实时荧光定量测定RBP1表达谱显示其在四膜虫营养生长和有性生殖过程中都有表达，并在有性生殖过程中表达水平提高，与四膜虫全基因转录Microarray数据(http://tfgd.ihb.ae.en)中RBP1基因的表达谱相一致。多物蛋白序列对比发现Rbp1p含有一个保守的Ran结合结构域(RBD)，并与Ran1蛋白具有相似的分子进化。
　　 2.Rbp1p在细胞内的定位将含有HA-tag的载体pNeo-HA-RBP1转入野生型四膜虫中，使其内源性编码HA-Rbp1p蛋白，以梯度增加巴龙霉素浓度的方法筛选阳性细胞株，使用PCR扩增鉴定。免疫荧光定位发现，在营养生殖期，Rbp1p定位于细胞胞质中，两个细胞核均成“空洞”状;在结合生殖初期Rbp1p定位于细胞质中，细胞核无定位，而后期即“anlagen”期时，Rbp1p除了定位于细胞质外，还定位于发生凋亡的旧大核上，直至旧大核完全凋亡。
　　 3.过表达Rbp1p导致细胞核分裂异常将过表达载体pXS-RBP1转入野生型四膜虫，RBP1基因通过同源重组替代MTT1基因，使得RBP1在Cd2+诱导下受到MTT1基因启动子调控而过量表达Rbp1p。结果表明Rbp1p过表达导致细胞生长速率下降，大核的无丝分裂异常，细胞分裂末期产生了无大核的异常细胞，同时导致了多小核的产生，并且上述异常依赖于Rbp1p的表达水平。
　　 4.敲减RBP1表达抑制大核无丝分裂将敲除载体pNeo-BP1转入野生型四膜虫，梯度增加巴龙霉素浓度筛选获得Neo4基因部分替代RBP1基因的敲减细胞株。结果表明敲减RBP1表达的细胞株生长速率下降，大核的无丝分裂受到抑制，细胞分裂末期产生了无大核的异常细胞。
　　 本研究首次鉴定了四膜虫RBP1基因，RBP1的过表达和敲减均导致细胞异常发育，这种异常表型与GTP和GDP锁定形式的RAN1突变体的表型相一致，暗示Rbp1p可以调节正常的Ran-GTP/GDP的浓度梯度，进而影响细胞核的发育。因此Rbp1p参与了Ran蛋白对大核无丝分裂及小核有丝分裂的调控进程，它的正常表达在四膜虫细胞增殖过程起到重要的调节作用。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 Ran蛋白网络

1．1．1 Ran蛋白网络

1．1．2 Ran蛋白活性的调控

1．1．3 Ran蛋白网络基本功能

1．2 Ran结合蛋白1

1．3 Ran结合蛋白1的结构

1．4 RanBP1的功能

1．4．1 RanBP1参与调控核质转运

1．4．2 RanBP1参与核膜重建

1．4．3 RanBP1参与调控DNA复制

1．4．4 RanBP1参与调控纺锤体组装

1．5 RanBP1的研究现状

1．5．1 RanBP1随细胞周期而变化

1．5．2 RanBP1对有丝分裂的调节

1．5．3 RanBP1对纺锤体组装的调节

1．5．4 RanBP1在细胞凋亡中的作用

1．6 四膜虫概述

1．7 本课题的研究意义

第二章 嗜热四膜虫中RBP1基因的鉴定及其序列分析

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 菌株和质粒

2．2．2 试剂与工具酶

2．2．3 实验所用引物

2．2．4 主要实验仪器

2．2．5 主要试剂配制

2．3 方法

2．3．1 嗜热四膜虫细胞的培养、饥饿与交配

2．3．2 嗜热四膜虫RBP1基因的克隆

2．3．3 RBP1基因的表达谱分析

2．3．4 Rbp1p蛋白序列及聚类分析

2．4 结果

2．4．1 RBP1基因序列的克隆

2．4．2 RBP1基因的表达谱分析

2．4．3 Rbp1p蛋白序列及进化分析

2．5 讨论

第三章 嗜热四膜虫中Rbp1p亚细胞定位分析

3．1 前言

3．2 材料

3．2．1 菌株和质粒

3．2．2 试剂与工具酶

3．2．3 实验所用引物

3．2．4 主要实验仪器

3．2．5 主要试剂配制

3．3 方法

3．3．1 嗜热四膜虫细胞的培养、饥饿和交配

3．3．2 嗜热四膜虫pXS-RBP1过表达载体的构建

3．3．3 嗜热四膜虫pNeo-HA-RBP1重组载体的构建

3．3．4 嗜热四膜虫细胞转化

3．3．5 阳性克隆的筛选

3．3．6 嗜热四膜虫基因组的快速提取与PCR鉴定

3．3．7 免疫荧光定位

3．4 结果

3．4．1 pNeo-HA-RBP1的构建及其重组鉴定

3．4．2 Rbp1p在嗜热四膜虫营养生殖时期的定位

3．4．3 Rbp1p在嗜热四膜虫接合时期的定位

3．5 讨论

第四章 嗜热四膜虫中Rbp1p异常表达导致细胞核分裂异常

4．1 前言

4．2 材料

4．2．1 菌株和质粒

4．2．2 试剂与工具酶

4．2．3 实验所用引物

4．2．4 主要实验仪器

4．2．5 主要试剂配制

4．3 方法

4．3．1 嗜热四膜虫细胞的培养

4．3．2 嗜热四膜虫pXS-RBP1过表达载体的构建

4．3．3 嗜热四膜虫pNeo-RBP1敲除载体的构建

4．3．4 嗜热四膜虫细胞转化

4．3．5 阳性克隆的筛选

4．3．6 实时荧光定量PCR

4．3．7 DAPI染色

4．4 结果

4．4．1 pXS-RBP1过表达载体的构建及其重组鉴定

4．4．2 不同浓度Cd2+诱导下RBP1基因转录水平的测定

4．4．3 过表达Rbp1p导致异常细胞核分裂

4．4．4 pNeo-RBP1载体的构建及其重组鉴定

4．4．5 敲减株RBP1基因转录水平的测定

4．4．6 RBP1敲减抑制大核无丝分裂

4．5 讨论

参考文献

附录Ⅰ

附录Ⅱ

总结与展望

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简况及联系方式

承诺书

声明