肽链释放因子与tRNA的协同进化对终止密码子重新分配的影响

摘要

当终止密码子UAA、UAG或者UGA到达核糖体A位点时，蛋白质翻译发生终止。在原核生物和真核生物中，该过程由两类肽链释放因子共同参与，但是二者的作用机制并不相同。原核生物第一类肽链释放因子有2个:RF1和RF2。RF1由线性三肽反密码子Pro-Ala-Thr(PAT)识别UAA和UAG，而RF2利用Ser-Pro-Phe(SPF)三肽反密码子识别UAA和UGA;第二类肽链释放因子RF3在肽链释放后通过GTP水解使第一类释放因子循环利用。而真核生物大多数只有一个第一类肽链释放因子，eRF1，负责识别三个终止密码子，但是它识别终止密码子的机制并不清楚;第二类肽链释放因子eRF3则促进某些终止信号的识别，并通过eRF1的释放来调节新生肽链的释放速率。
　　 由于真核生物中两类肽链释放因子的协同作用在肽链合成终止和释放过程发挥着重要的作用，而在原核生物中，第二类肽链释放因子RF3只能协同GTP在翻译终止后促使RF1/2从核糖体上解离，两者之间没有相互作用关系。学者认为滴虫线粒体形成之间产生，是原生动物中最为原始的一个类群。其肽链释放因子的结构与进化程度较高的纤毛虫和高等真核生物相比具有明显的差异。在本实验中，我们将克隆得到的滴虫两类肽链释放因子的基因Tv eRF1和Tv eRF3分别连接到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7中，然后共转化酵母菌株AH109。利用酵母双杂交技术我们证实滴虫的eRF1和eRF3存在相互作用关系，说明滴虫的两类肽链释放因子通过相互作用，协同参与蛋白质翻译终止过程。这为进一步研究参与蛋白质翻译终止的肽链释放因子的进化和生物的进化之间的关系提供了数据支持。
　　 在进化过程中纤毛虫把部分公认的终止密码子重新分配成有义密码子。草履虫、四膜虫、棘尾虫和尖毛虫只用UGA做为终止密码子，而用UAA和UAG编码谷氨酸;而游仆虫则将UGA翻译为半胱氨酸，UAA和UAG识别为终止密码子。有研究认为纤毛虫密码子的重分配可能由RF结构和功能的变化、突变压力和新的tRNA出现引起，其中eRF1结构上的改变可能在终止密码子的重分配中起主要作用。
　　 首先本实验构建了原生动物贾第虫eRF1杂合基因G1/Sc eRF1，它由贾第虫eRF1的N端和酿酒酵母eRF1的M端、C端结构域组成。把该重组质粒转入敲除内源eRF1的酵母菌株YDB447中分析其识别终止密码子的活性和性质。质粒洗牌技术的研究结果表明，G1/Sc eRF1作为唯一的eRF1能支持细胞生长，而双荧光素酶报告系统分析却发现G1/Sc eRF1不识别三个终止密码子。对eRF1N端的关键氨基酸突变后发现GTS环结构可能负责识别UAG中的第三位碱基G3，而“YCF”模体对UGA的识别最为有效。
　　 其次我们在先前构建好的Eo/Sc eRF1b的基础上，对eRF1识别终止密码子3个碱基的三个“口袋（cavity）”结构周围的关键氨基酸进行组合突变发现，口袋1周围的关键氨基酸的突变使得Eo eRF1b识别UAA和UAG的第二位碱基A2;M51、E55、Y125的突变与UGA的识别最相关。另外，本实验还从八肋游仆虫中分离出UGA阻抑性tRNA，说明八肋游仆虫中终止密码子的重新分配很可能是由eRF1和阻抑性tRNA协同作用的结果。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 第一类肽链释放因子

1．1．1 第一类肽链释放因子的结构

1．1．2 第一类肽链识别终止密码子的机制

1．2 蛋白质合成终止过程中各因子之间相互作用

1．3 蛋白质合成终止过程中各因子在进化上存在一定的协同性

1．4 蓝氏贾第鞭毛虫、滴虫和八肋游仆虫的特点及本课题的研究意义

1．4．1 蓝氏贾第鞭毛虫

1．4．2 滴虫

1．4．3 八肋游仆虫

1．4．4 本课题研究的意义

第二章 滴虫两类肽链释放因子的相互作用

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 主要试剂的配制

2．1．3 主要的酶和生化试剂

2．2 实验方法

2．2．1 酵母双杂交重组质粒的构建

2．2．2 酵母双杂交重组质粒的共转化

2．2．3 β-半乳糖苷酶活性分析

2．3 实验结果

2．3．1 酵母双杂交重组质粒的构建

2．3．2 酵母双杂交实验

2．4 讨论

第三章 贾第虫eRF1及突变体识别终止密码子的性质和活性分析

3．1 材料

3．1．1 实验菌株和质粒

3．1．2 试剂、引物合成及测序

3．1．3 试剂的配制

3．2 方法

3．2．1 贾第虫杂合eRF1(Gl／Sc eRF1)的构建(含HA标签)

3．2．2 定点突变

3．2．3 质粒洗牌技术和双荧光素酶通读效率实验

3．2．4 Western blot

3．3 实验结果

3．3．1 重组质粒pDB086的构建

3．3．2 贾第虫eRF1突变质粒的构建

3．3．3 贾第虫eRF1野生型和突变体识别终止密码子的活性分析

3．3．4 贾第虫eRF1野生型和突变体的识别性质分析

3．3．5 Gl／Sc eRF1杂合蛋白在酵母细胞中稳定表达

3．4 讨论

第四章 游仆虫eRF1b突变体识别终止密码子的性质和活性分析

4．1 材料与方法

4．1．1 实验菌株及质粒

4．1．2 试剂、引物合成及测序

4．1．3 定点突变

4．1．4 tRNA的克隆

4．1．5 质粒洗牌技术和双荧光素酶通读效率实验

4．1．6 Western blot

4．2 结果

4．2．1 Eo eRF1b突变质粒的构建

4．2．2 Eo eRF1b野生型和突变体识别终止密码子的活性分析

4．2．3 Eo eRF1b的N端结构域中对密码子识别具有影响作用的氨基酸残基

4．2．4 tRNA的克隆

4．3 小结

总结与展望

参考文献

附录

攻读硕士期间取得的研究成果

致谢

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