Rhodococcus sp.R04羟基联苯1,2-双加氧酶多样性及其功能研究

摘要

联苯的氯代衍生物多氯联苯(PCBs)是广泛应用的重要工业原料。它是一种严重的环境污染物，对人类有致癌作用。多氯联苯的微生物好氧降解是通过联苯代谢途径进行的。联苯的上游代谢途径需要四个酶的参与，其中2，3-二羟基联苯双加氧酶(BphC)属于外部双加氧酶的一种，它在联苯和多氯联苯的降解中是一个非常关键的酶，其结构，功能和底物特异性等方面已成为该领域研究的热点。
　　 Rhodococcussp.R04基因组测序发现，该基因组中含有8个bphC基因，分别命名为bphC1至bphC8。基于氨基酸序列的相似性和外部双加氧酶的分类，BphC1，BphC2，BphC3，BphC8属于类型Ⅰ，BphC4，BphC5，BphC6，BphC7属于类型Ⅱ。8个BphC之间的氨基酸序列相似性为11％～77％。根据全基因组序列设计引物，从Rhodococcussp.R04基因组中扩增出8个bphC基因，将它们分别克隆到表达载体pBV220-His中，并获得了表达。用离子交换一步层析，获得了电泳纯的BphC8，SDS-PAGE和分子排阻层析表明它是一个亚基分子量为35KD左右的同源六聚体。最适温度和最适pH分别为20℃和9.0。
　　 我们将bphC2克隆到温度诱导的表达载体pBV220和化学诱导的表达载体pET21a中，构建了重组质粒pBV220-bphC2和pET21a-bphC2。通过表达获得了可溶性的BphC2酶和具有BphC2酶活性的包涵体，上清经离子交换和硫酸铵沉淀获得了电泳纯，包涵体将五步法洗涤获得了电泳纯。在此基础上，对纯化后的可溶性BphC2和包涵体做了热稳定性，化学修饰剂和氧化剂对它们的影响以及确定获得高活性的包涵体的最佳条件和对包涵体的定位。结果表明，与可溶性BphC2相比，包涵体的热稳定性较差，在60℃温浴1h，可溶性部分酶活剩余47％，而包涵体仅剩15％。邻氮二杂菲和过氧化氢对包涵体的抑制作用比较强烈，而高浓度的EDTA(5mmol/L)对包涵体的活性增加了11％，低浓度的DTT(1mmol/L)对包涵体的活性增加了一倍多。对温度诱导型载体pBV220而言，用42℃诱导4h是获得高活性包涵体的最佳条件，对化学诱导型载体pET21a而言，低温(16℃)诱导是获得高活性包涵体的最佳条件。利用诱导表达后的细胞作用底物2，3-二羟基联苯，生成的HOPDA在480nm处进行荧光激发，在520nm处获得最高荧光值，通过DeltaVision共聚焦显微镜确定包涵体位于细胞质的两极。
　　 为了研究Rhodococcussp.R04中BphC2的C-端区域对酶的活性，热稳定性及分子构象的影响，设计了C-端依次截短1～9个氨基酸残基的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pET21a-bphC295为模板，通过PCR扩增获得各突变体的基因片段，并将它们分别克隆到pET21a载体中，经诱导表达后显示随着C-末端截短残基的增多，上清中可溶性目的蛋白的含量越来越少，当截短5个氨基酸残基后，目的蛋白全进入包涵体中。通过测定和比较野生型BphC295和截短1～4个氨基酸残基的突变酶(BphC291，BphC292，BphC293，BphC294)的酶活，热稳定性，动力学常数及寡聚体形式，结果显示与野生型BphC295比较，突变体酶的比活明显降低，野生型酶比活是突变酶BphC291比活的27倍。当截短4个氨基酸残基后酶分子的聚合状态有六聚体变成了四聚体。与野生型酶比较，突变酶BphC292，BphC293，BphC294热稳定性没有多大变化，而突变酶BphC291热稳定性较差，表明酶的稳定性与其分子的完整性密切相关。对动力学参数的分析显示，突变酶与野生型酶相比，底物专一性未发生显著改变，最适底物仍为2，3-二羟基联苯，但突变酶对各底物的的亲和力Km值不断下降，催化速率Kcat/Km也不断减小。可见，酶活性的丧失是由于C-端残基缺失影响了酶对底物的亲和力使反应速度降低所致。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 2，3-二羟基联苯双加氧酶的概况

1．1 双加氧酶概述

1．2 外部双加氧酶的分类

1．3 2，3-二羟基联苯双加氧酶的结构

1．4 2，3-二羟基联苯双加氧酶的催化机制

2 2，3-二羟基联苯双加氧酶的多样性

2．1 不同微生物中BphC的多样性和功能

2．2 BphC的一级结构比较

2．3 BphC的二级结构比较

3 2，3-二羟基联苯双加氧酶的聚合形态

3．1 不同菌种中BphC的聚合形态

3．2 包涵体组成成分

3．3 包涵体形成原因

3．4 包涵体特点

3．5 包涵体研究进展

4 本论文研究的目的和意义

参考文献

第二章 Rhodococcus sp．R04中2，3-二羟基联苯1，2-双加氧酶多样性

1 材料

1．1 菌株和载体

1．2 培养基

1．3 主要的酶和化学试剂

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 Rhodococcus sp．R04中8个BphC基因的序列分析

2．2 Rhodococcus sp．R04中8个BphC一级结构序列比对

2．3 建立系统发育树

2．4 Rhodococcus sp．R04中8个bphC基因的克隆

2．5 8个BphC的表达

3 结果

3．1 Rhodococcus sp．R04中8个BphC的序列分析

3．2 Rhodococcus sp．R04中8个BphC一级结构序列比对分析

3．3 BphC系统发育分析

3．4 Rhodococcus sp．R04中8个bphC基因的扩增及重组子的鉴定

3．5 8个BphC的表达

4 讨论

参考文献

第三章 具有活性的BphC2包涵体及其生化特性

1 材料

1．1 菌株和载体

1．2 培养基

1．3 主要的酶和仪器

2 方法

2．1 Rhodococcus sp．R04中2， 3-二羟基联苯双加氧酶基因bphC2的克隆

2．2 BphC2的表达

2．3 BphC2粗酶液纯化

2．4 BphC2包涵体纯化

2．5 酶活及蛋白含量测定

2．6 纯化的可溶性BphC2和包涵体的化学修饰

2．7 纯化的可溶性BphC2和包涵体的热稳定性测定

2．8 具有活性包涵体的酶活性与浊度测定

2．9 HOPDA的荧光共谱扫描

2．10 Delta Vision观察宿主菌中包涵体的位置

3 结果

3．1 Rhodococcus sp．R04中bphC2基因的扩增及重组子的鉴定

3．2 BphC2的表达

3．3 可溶性BphC2的纯化

3．4 包涵体的纯化

3．5 化学修饰剂对纯化的可溶性BphC2和包涵体酶活的影响

3．6 纯化的可溶性BphC2和包涵体的热稳定性

3．7 具有活性包涵体酶活性与浊度的比值

3．8 HOPDA的荧光共谱分析

3．9 确定诱导后的宿主菌中包涵体的位置

4 讨论

参考文献

第四章 截短型BphC2的表达纯化和部分性质研究

1 材料

1．1 菌株和载体

1．2 培养基

1．3 主要的酶和化学试剂

2 方法

2．1 C-端截短型bphC2的克隆

2．2 突变体重组质粒的构建

2．3 C-端截短型BphC2的表达

2．4 C-端截短型BphC2的纯化

2．5 酶活性测定

2．6 蛋白浓度测定

2．7 突变酶的热稳定性测定

2．8 突变酶寡聚体分析

3 结果

3．1 C-端截短型bphC2的克隆

3．2 C-端截短型bphC2的表达

3．3 C-端截短型BphC2的纯化

3．4 野生型BphC2295和突变酶的动力学常数

3．5 突变酶的热稳定性变化

3．6 突变酶的分子形式

4 讨论

参考文献

第五章 Rhodococcus sp．R04 BphC8的纯化和部分性质研究

1 材料

1．1 菌株和载体

1．2 培养基

1．3 主要化学试剂

2 方法

2．1 Rhodococcus sp．R04 BphC8的纯化

2．2 最适pH和pH稳定性测定

2．3 最适温度和热稳定性测定

2．4 天然分子量的测定

2．5 金属离子和某些化合物对BphC8酶活性的影响

2．6 动力学参数的测定

2．7 圆二色性分析

3 结果与分析

3．1 Rhodococcus sp．R04 BphC8 的纯化

3．2 BphC8最适pH和pH稳定性

3．3 BphC8最适温度和热稳定性

3．4 BphC8的天然分子量

3．5 金属离子和某些化合物对BphC8活性的影响

3．6 BphC8对不同底物的动力学的常数

3．7 BphC8的圆二色性

3．8 Rhodococcus sp．R04中三个BphC的比较

参考文献

小结

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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