蜡蚧霉侵染白蜡绵粉蚧的组织病理学及昆虫病原真菌代谢物的分离纯化

摘要

白蜡绵粉蚧(Phenacoccus fraxinus Tang)是白蜡树上一种刺吸性害虫,该虫体表具有多种蜡腺,在生长发育过程中可分泌大量对虫体具有保护作用的蜡质。现已在我国多个省市危害猖獗,严重影响了树势和城市景观。化学防治效果不理想,且严重污染环境。对白蜡绵粉蚧的生物防治尚未见报道。在生物防治中,蜡蚧霉(Lecanicilliurn lecanii)和布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)是应用广泛的两种昆虫病原真菌,其代谢物在对昆虫的致病过程中发挥了重要作用。真菌代谢物成分复杂,以往分离纯化代谢物的步骤繁琐且不易得到纯品。高速逆流色谱技术是一种新型的分离技术,已经广泛应用于天然产物的分离纯化,但利用高速逆流色谱技术分离纯化病原真菌代谢物的报道很少。
　　本文研究了L.lecanii3.4505对白蜡绵粉蚧的致死率,通过光学显微镜、扫描电镜与透射电镜研究了蜡蚧霉对白蜡绵粉蚧的侵染过程以及白蜡绵粉蚧被感染后的组织病理变化。同时,利用高速逆流色谱对L.lecanii3.4505和B.brongniartii2382菌株的代谢产物进行分离纯化,利用GC/MS分析检测分离产物。这些研究可为昆虫病原真菌的杀虫机制研究和利用该菌防治害虫提供理论依据。
　　研究结果如下:
　　1.L.lecanii3.4505菌株对2龄白蜡绵粉蚧雌、雄若虫生物测定结果显示:L.lecanii3.4505菌株对2龄白蜡绵粉蚧雌、雄若虫有较高的感染致死率,2d后雌、雄若虫的死亡率就达到40％以上,5d后的死亡率达到90%。该菌能在短时间内完成对白蜡绵粉蚧虫的侵染,这可能是由于白蜡绵粉蚧2龄若虫本身虫体弱小和分泌的粉状干蜡尚不能够阻止蜡蚧霉入侵。
　　2.采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜技术,系统地观察研究了L.lecanii3.4505菌株孢子在白蜡绵粉蚧若虫体表附着、萌发、菌丝穿透体壁的过程和对内部组织的侵染及其引起的组织病理学变化。研究发现:L.lecanii3.4505分生孢子感染蚧虫后,分生孢子主要附着虫体节间褶、体表的凹陷处、与寄主植物接触的体缘部位,这些地方成为蜡蚧霉侵染蚧虫的重要途径,这表明蜡蚧霉孢子可冲破蚧虫蜡质的疏水性和抑菌作用在虫体某些部位附着。孢子随后萌发,一端膨大形成附着胞,紧紧固着在体表。芽管继续生长形成菌丝,菌丝沿寄主体表在蚧虫分泌的蜡质中穿过,有些菌丝前端特化形成锥状侵入钉,并寻找合适的入侵位点穿透寄主表皮。孢子或菌丝在生长过程中分泌大量的粘液,这些粘液会对寄主表皮造成明显的物理性破坏。染菌2d后,菌丝已经将寄主体壁结构破坏完全进入其体内。进入血腔之后,菌丝利用寄主血腔中的物质作为生长所必需的营养物质迅速生长,生成大量的芽生孢子。血细胞中的各种细胞器都被破坏,内质网扩张、聚集成指纹状;线粒体变形、肿胀、膜破裂、嵴突变形。肌肉中肌细胞内的线粒体同样遭到严重破坏,肌原纤维界限不清,成不规则状态,部分肌丝断裂甚至溶解。气管、脂肪体、马氏管、肠和神经节等多种内部器官均受到不同程度的破坏,最后菌丝完全占据了寄主的整个血腔,整个虫体被白色的菌丝体包裹,菌丝成辐射状向外延伸。
　　3.利用高速逆流色谱技术,通过两相溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶5∶4∶5)从蜡蚧霉发酵液的乙酸乙酯粗提物中可一步分离纯化得到苯酚、二甲苯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯。其中邻苯二甲酸二丁酯的含量较高,面积归一法计算纯度为98%。
　　4.利用高速逆流色谱技术,通过两相溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3.5∶5∶3.5∶5)从白僵菌发酵液的乙酸乙酯粗提物中可一步分离纯化得到2-香豆满酮、间甲基苯甲酸甲酯、对甲基苯甲酸甲酯和邻苯二甲酸二丁酯。GC检测其纯度分别为81%、89%、80%和78%。
　　5.白僵菌代谢物测定结果表明,间甲基苯甲酸甲酯和对甲基苯甲酸甲酯均对油松毛虫产生不同程度的毒性。间甲基苯甲酸甲酯对油松毛虫幼虫的死亡率分别是饲喂法34.44%、接触法35.56%、注射法87.78%,而对甲基苯甲酸甲酯对油松毛虫幼虫的死亡率分别是37.78%、38.89%、91.11%。

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第一章 前言

1.1白蜡绵粉蚧的危害及其防治

1.2 虫生真菌蜡蚧霉和白僵菌在生物防治中的应用

1.3虫生真菌的致病机理研究

1.4本文研究的内容、方法、目的及意义

第二章 白蜡绵粉蚧感染蜡蚧霉后的组织病理变化

2.1材料

2.2方法

2.3研究结果

2.4 讨论

2.5 结论

第三章 蜡蚧霉代谢产物的分离纯化

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 结论

第四章 布氏白僵菌代谢物的分离纯化及其对油松毛虫幼虫的毒性研究

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.3 讨论

4.4 结论

第五章 总结

参 考 文 献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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