CBL黑豆对大豆胞囊线虫4号生理小种抗性机制研究

摘要

大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）严重危害大豆生产。大豆胞囊线虫有16个生理小种，其中4号生理小种的致病性最强，主要分布在黄淮海大豆主产区。发掘新抗源和新抗病基因是解决该病的最经济有效的手段。本课题经过多年筛选，发现CBL黑豆高抗大豆胞囊线虫4号生理小种。本研究探讨了CBL黑豆抗大豆胞囊线虫4号生理小种的机制，为大豆抗病育种提供理论依据。本研究通过酸性品红染色法观察线虫在根系内的发育状况，明确了CBL黑豆的抗病类型;通过测定防御酶系活性变化，初步探索CBL黑豆抗病的生化机制;通过转录组测序，筛选差异表达基因，分析了CBL黑豆抗病的分子机制;同时通过同源克隆得到CBL-HSPRO2基因，分析其相关生物学信息，为进一步的基因鉴定奠定基础。
　　主要研究结果如下:
　　1.CBL黑豆对大豆胞囊线虫4号小种的抗性表现为抗发育型。CBL黑豆不能抵抗大豆胞囊线虫4号小种的入侵，但却抑制部分二龄幼虫发育为三龄幼虫，抑制几乎全部三龄幼虫发育为四龄幼虫。
　　2.POD、PPO、SOD和PAL参与了CBL黑豆对大豆胞囊线虫4号小种的抗病过程。CBL黑豆接种大豆胞囊线虫后，根系内的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性较未接种组的均表现升高，说明防御酶系POD、PPO、SOD和PAL的活性变化与CBL黑豆对大豆胞囊线虫4号小种的抗性密切相关。
　　3.激素信号转导，能量代谢，苯丙氨酸代谢等途径参与了CBL黑豆对大豆胞囊线虫4号小种的抗病过程。利用高通量测序技术对被大豆胞囊线虫侵染后的两个发育时期的CBL黑豆的根组织进行了转录组测序，筛选后共获得了6390个差异表达基因，第一时期和第二时期分别有2180个和4210个差异表达基因，两个时期的共表达差异基因有840个，其中，表达上调基因分别有1604个和1414个，表达下调基因分别有1116个和2796个。对差异表达基因进行GO和COG功能注释，以及KEGG富集分析。根据GO注释，与抗病相关的差异基因功能分类到胞外区域，抗氧化活性，以及细胞杀伤相对较多;根据KEGG富集分析，大量差异基因参与到激素信号转导途径，苯丙氨酸代谢，能量代谢等过程。
　　4.同源克隆得到了全长1356bp的CBL-HSPRO2基因，从蛋白理化性质，结构域预测，二级结构预测等方面分析了该基因所编码的蛋白的相关生物学信息，同时构建了CBL-HSPRO2基因的表达载体pGFPGUS-CBL-HSPRO2并成功转化到农杆菌中。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 大豆胞囊线虫的危害，生活史以及生理小种的划分

1．1．1 大豆胞囊线虫的危害

1．1．2 大豆胞囊线虫的生活史

1．1．3 大豆胞囊线虫的生理小种划分

1．2 大豆对胞囊线虫的抗性机制

1．2．1 大豆抗胞囊线虫卵孵化

1．2．2 大豆抗胞囊线虫的发育繁殖

1．2．3 大豆抗胞囊线虫的生化机制

1．2．4 大豆抗大豆胞囊线虫的分子机制

1．3 转录组测序的研究进展

1．3．1 Illumina测序技术

1．3．2 转录组测序的应用

1．4 植物抗线虫基因的研究进展

1．4．1 大豆抗胞囊线虫的抗病基因

1．4．2 其他植物抗线虫基因

1．5 本研究的目的意义

第二章 大豆胞囊线虫在抗感大豆品种根部的发育

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 实验试剂及配制方法

2．2 实验方法

2．2．1 大豆胞囊线虫4号小种卵液的制备

2．2．2 CBL黑豆的抗性鉴定

2．2．3 不同发育时期根系的采集

2．2．4 酸性品红染色法染色根系内线虫

2．3 结果与分析

2．3．1 CBL黑豆抗性鉴定结果

2．3．2 抗感材料根系中大豆胞囊线虫的发育动态

2．4 讨论

第三章 CBL黑豆抗胞囊线虫4号小种的生理生化机制

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 线虫的繁殖

3．1．3 材料的处理和采集

3．2 实验方法

3．2．1 粗酶液的制备

3．2．2 过氧化物酶(POD)活性的测定

3．2．3 多酚氧化酶(PPO)活性的测定

3．2．4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

3．2．5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定

3．2．6 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 过氧化物酶(POD)活性变化

3．3．2 多酚氧化酶(PPO)活性变化

3．3．3 超氧化物歧化酶(SOD)活性变化

3．3．4 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化

3．4 讨论

第四章 CBL黑豆转录组测序及其分析

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 实验试剂

4．1．3 Real-time PCR引物

4．2 实验方法

4．2．1 试验处理和取样

4．2．2 测序

4．2．3 生物信息学分析

4．2．4 Real-time PCR验证分析

4．3 结果与分析

4．3．1 取样时间的确定

4．3．2 测序数据统计

4．3．3 差异表达基因分析

4．3．4 Real time PCR结果

4．4 讨论

第五章 CBL-HSPRO2基因的生物信息学分析及表达载体的构建

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 菌株与载体

5．2 实验方法

5．2．1 总RNA的提取

5．2．2 反转录

5．2．3 PCR扩增目的基因

5．2．4 目的基因的克隆

5．2．5 植物表达载体的构建

5．2．6 冻融法转化发根农杆菌

5．3 生物信息学分析

5．3．1 CBL-HSPRO2蛋白理化性质的分析

5．3．2 CBL-HSPRO2蛋白跨膜区和信号肽分析

5．3．3 CBL-HSPRO2蛋白的二级结构预测

5．4 结果与分析

5．4．1 CBL-HSPRO2基因的信息学分析结果

5．4．2 CBL-HSPRO2基因的克隆

5．4．3 CBL-HSPRO2基因植物表达载体的构建

5．4．4 植物表达载体转化发根农杆菌及其鉴定

5．5 讨论

第六章 全文结论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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