飞蝗几丁质酶家族基因功能及RNAi介导的害虫防治应用研究

摘要

几丁质是昆虫表皮重要的组成成分，几丁质酶（EC3.2.1.14）是一类内切酶，参与昆虫表皮几丁质的降解，在昆虫蜕皮发育的生命活动中起着关键作用。昆虫几丁质酶是由多基因编码的，昆虫几丁质酶家族基因（Chitinase familygenes，Chts）广泛参与发育、消化和免疫等生命活动。因为人类和其他高等动物体内没有几丁质，针对几丁质代谢途径进行害虫防治相对安全。近年来，随着RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）的迅速发展，这项新技术已开始应用于昆虫基因功能及害虫防治中。本研究利用飞蝗（Locusta migratoria）对RNAi的敏感性，通过干扰几丁质酶基因的表达来影响几丁质的代谢，进而破坏昆虫的正常蜕皮而导致其死亡；并基于几丁质代谢途径开展dsRNA分子靶标筛选，建立RNAi介导的害虫控制体系。本研究成果将有力促进分子靶标创新及植保新技术的研发，具有重要的理论意义和实践应用价值。 本研究基于重要农业害虫飞蝗基因组及转录组数据库，对飞蝗几丁质酶家族基因开展了系统全面的研究。克隆获得16个几丁质酶基因并研究其分子特性；采用RNAi技术筛选到2个与蜕皮相关且具有重要功能的几丁质酶基因；进一步选择高效抗虫的dsRNA用于选育表达dsRNA的转基因抗虫玉米。主要研究结果如下： 一、获得16个飞蝗几丁质酶家族基因 对飞蝗转录组数据库进行搜索获得飞蝗几丁质酶基因部分序列，采用RACE-PCR技术克隆得到16个飞蝗几丁质酶家族基因cDNA全长序列。与已知动物几丁质酶进行N-J聚类分析后发现：除LmCht9外，其余15个基因均分布在昆虫几丁质酶基因的9个聚类簇中；LmCht1与LmCht7在脊椎动物中有同源基因的存在。16个基因cDNA序列长度差异较大，预测的结构域数量也明显不同。利用飞蝗的基因组数据库，对所获得的16个几丁质酶基因进行基因结构分析，发现LmCht1仅有1个外显子，其余几丁质酶基因均有多个内含子，且内含子序列较长。 二、明确了几丁质酶家族基因的表达特性 16个几丁质酶家族基因在飞蝗5龄若虫不同组织部位及不同发育过程的表达图谱显示：几丁质酶家族基因表达差异显著。其中LmCht5-1、LmCht5-2和LmCht10在飞蝗体壁、前肠和后肠中表达较高，可能参与飞蝗蜕皮前旧表皮几丁质的降解；3个基因在卵期不同发育天数的表达呈现出各自的表达高峰，暗示这些基因可能在卵期不同发育阶段起到关键作用。通过测定分析飞蝗发育过程中蜕皮激素（ecdysone）信号的变化，发现LmCht5-1、LmCht5-2和LmCht10的发育表达图谱与激素信号图谱有相同趋势。通过干扰蜕皮激素受体和对飞蝗体腔注射20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone，20E），分析3个基因的表达变化，结果表明其均严格受蜕皮激素调控，参与到飞蝗蜕皮发育过程中。 三、发现飞蝗Ⅰ组Cht5有两个同源基因且功能出现分化 本研究首次发现渐变态昆虫中Ⅰ组几丁质酶基因出现同源基因，这一现象之前仅在蚊类昆虫有报道。与蚊类Cht5出现的同源基因不同，N-J聚类树分析表明LmCht5-1和LmCht5-2均与其他昆虫Cht5直系同源。对二者几丁质酶催化域保守序列进行分析，结果表明关键位点的氨基酸残基“DWEYP”未发生突变，暗示LmCht5-1和LmCht5-2均具有几丁质酶催化活性。利用RNA干扰研究其生物学功能，发现LmCht5-1缺失可影响飞蝗5龄若虫至成虫的正常蜕皮，而LmCht5-2缺失并不影响飞蝗的正常发育。两个同源基因功能出现分化，LmCht5-1参与飞蝗5龄若虫蜕至成虫的生命活动过程，为该时期飞蝗蜕皮发育的关键基因。 四、解析了LmCht10在飞蝗发育过程中的重要生物学功能 采用RNAi技术系统研究了LmCht10的生物学功能，发现在飞蝗若虫期任一龄期LmCht10的沉默均会影响若虫的正常蜕皮。飞蝗成虫注射dsLmCht10后，雌虫产卵量下降，并且卵中LmCht10表达受到抑制，导致若虫破壳后卵包膜无法蜕去而致死。解剖获得LmCht10干扰后5龄不同发育天数的飞蝗体壁，开展基因沉默效率检测、几丁质酶活性测定、体壁组织切片及几丁质含量测定等实验，从分子水平、蛋白水平、组织水平及生物化学水平等多方面证明LmCht10对旧表皮中几丁质降解起主要作用，是维持飞蝗整个蜕皮发育过程的必要关键基因 五、筛选获得高效特异的抗虫dsRNA分子靶标 对飞蝗几丁质酶家族基因以及几丁质酶降解外切酶β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetylglucosaminidase，NAG）进行RNA干扰，结果表明，仅dsLmCht5-1、dsLmCht10与dsLmNAG可致死飞蝗，其中dsLmCht10对飞蝗的致死率最高。进一步分析表明：飞蝗、中华稻蝗（Oxya chinensis）与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）中Cht10的表达抑制均会导致虫体蜕皮受阻而死亡，暗示不同昆虫物种中Cht10具有功能上的保守性。选择LmCht10不同区域cDNA序列合成dsRNA，研究其对不同昆虫的抗虫效果。结果表明：位于LmCht10催化区域（chitinasecatalytic domain,CCD）的cDNA在不同物种中高度保守，合成dsRNA（dsCCD）分别注射飞蝗、中华稻蝗和赤拟谷盗，三种昆虫的致死率均达到90%以上；而依据位于飞蝗与中华稻蝗特有几丁质结合域（chitin binding domain,CBD）的cDNA合成dsRNA（dsCBD）分别注射飞蝗、中华稻蝗和赤拟谷盗，发现仅对两种蝗虫有致死效果，而不影响赤拟谷盗的正常发育。上述结果表明：LmCht10不同dsRNA具有不同的杀虫谱，dsCCD可用于多种害虫的防治，而dsCBD可用于蝗科害虫的防治。 六、获得表达dsLmCht10的转基因抗虫玉米 选择LmCht10的dsCCD区域cDNA片段构建重组质粒，通过花粉介导法对玉米品种郑58进行基因转化，经连续自交和分子检测筛选在T3代成功获得4个阳性转化株系dsLmCht10-l1至dsLmCht10-l4。生物学测定结果表明：取食这4个株系叶片后，1龄飞蝗若虫均出现因蜕皮困难而致死的现象。选择致死率最高的株系dsLmCht10-l1采用northern blot分析检测植物中dsRNA表达情况，并检测其喂食后飞蝗若虫LmCht10的表达量。实验结果表明，dsRNA在转基因玉米植株中的主要存在形式为siRNA，1龄飞蝗若虫取食叶片后，LmCht10表达受到抑制，部分若虫因蜕皮困难而死亡，死亡率达到53%。 综上所述，本文采用生物信息学方法和RACE-PCR技术获得16个飞蝗几丁质酶基因cDNA全长序列；采用RT-qPCR技术研究上述基因的组织分布和发育表达变化；采用RNAi技术筛选获得高效致死飞蝗的几丁质降解酶基因LmCht10，进一步研究LmCht10不同区域cDNA合成的dsRNA对不同昆虫的抗虫效果；选用高效致死且具有广谱抗虫效果的dsCCD用于转基因作物培育，获得4个转基因玉米株系，生物学测定表明其具有良好的抗虫能力。本研究获得了针对昆虫几丁质代谢途径的高效dsRNA分子靶标，建立了基于RNAi的害虫控制技术体系，将会促进植物保护新技术的研发，具有重要的理论意义和实践应用价值。

目录

第一章 前 言

1.1 几丁质

1.1.1几丁质概述

1.1.2昆虫与几丁质

1.2几丁质酶

1.2.1昆虫几丁质酶的结构特性

1.2.2昆虫几丁质酶的分类与生物学功能

1.2.3 几丁质酶与人类健康

1.2.4几丁质酶应用及展望

1.3 RNA干扰

1.3.1 RNAi机制

1.3.2 昆虫RNAi

1.3.3 RNAi在害虫防治中的应用展望

1.4 转基因作物

1.4.1转基因技术概述

1.4.2 RNAi介导的转基因抗虫研究进展

1.5本文研究意义及主要内容

第二章 飞蝗几丁质酶家族基因的分子特性

2.1实验材料与试剂

2.1.1 供试飞蝗

2.1.2 实验试剂与仪器

2.2研究方法

2.2.1 LmChts片段的获得与分析

2.2.2 LmChts cDNA全长序列获得

2.2.3 LmChts基因组结构分析

2.2.4 LmChts氨基酸推导与分析

2.2.5 昆虫和脊椎动物几丁质酶系统发育树的构建

2.2.6 LmChts功能域分析

2.3 实验结果

2.3.1 LmChts cDNA全长序列

2.3.2 LmChts 氨基酸序列推导与分析

2.3.3 LmChts基因结构分析

2.3.4 昆虫与脊椎动物几丁质酶的系统发育树

2.3.5 LmChts功能域保守位点分析

2.4 讨论

第三章 飞蝗几丁质酶家族基因的表达特性

3.1材料与试剂

3.1.1飞蝗饲养

3.1.2主要试剂与仪器

3.2实验方法

3.2.1飞蝗解剖

3.2.2飞蝗不同天数卵的收集

3.2.3 dsLmEcR处理

3.2.4 药物处理

3.2.5 cDNA模板制备

3.2.6 RT-qPCR检测与数据分析

3.3实验结果

3.3.1 LmChts不同组织部位的表达图谱

3.3.2 卵发育期LmChts的表达图谱

3.3.3 飞蝗若虫及成虫期LmChts的表达图谱及与激素调控的关系

3.3.4飞蝗蜕皮相关几丁质酶基因筛选结果

3.4讨论

第四章 飞蝗Ⅰ组几丁质酶基因的分子特性及功能研究

4.1实验材料与试剂

4.1.1飞蝗

4.1.2实验试剂与仪器

4.2方法

4.2.2 昆虫Cht5s系统发育树的构建

4.2.3 Cht5s催化域比对分析

4.2.4 LmCht5s的表达特性研究

4.2.5 RNA干扰及表型观察

4.3结果

4.3.1 LmCht5s分子特性的差异分析

4.3.2 LmCht5s组织分布及发育表达差异分析

4.3.3 LmCht5s干扰后表型及功能差异分析

4.4讨论

第五章 飞蝗几丁质酶基因10的分子特性及功能研究

5.1实验材料与试剂

5.1.1飞蝗

5.1.2实验试剂与仪器

5.2方法

5.2.1 昆虫Cht10功能域分析

5.2.2 LmCht10若虫RNA干扰

5.2.3几丁质酶酶活检测

5.2.4体壁切片染色与观察

5.2.5几丁质含量检测

5.2.6 LmCht10成虫RNA干扰

5.2.7 RNAi后卵期表达检测

5.3结果

5.3.1 昆虫Cht10结构特征

5.3.2 LmCht10对飞蝗若虫表皮发育影响

5.3.3 LmCht10对飞蝗卵发育影响

5.4讨论

第六章 转基因抗虫玉米的培育

6.1材料与试剂

6.1.1供试材料

6.1.2主要试剂与仪器

6.2研究方法

6.2.1靶标基因筛选

6.2.2 靶标dsRNA筛选

6.2.3 转基因作物培育

6.2.5 northern blot 检测

6.3结果

6.3.1 飞蝗靶标基因筛选

6.3.2 中华稻蝗OcCht10序列的获得及生物学功能研究

6.3.3 LmCht10 dsRNA筛选

6.3.4转基因玉米的培育

6.3.5转基因玉米对飞蝗发育的影响

6.4讨论

全文总结

参考文献

博士期间研究成果

致谢

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