重金属Cu2+对克氏原螯虾的免疫毒性研究

摘要

近年来，我国水域环境的污染状况日趋严重。2003-2014年的《中国环境状况公报》均指出：重金属铜是我国渔业水域的主要污染物之一。即使在较低的浓度，铜也能够抑制甲壳动物的免疫功能，提高宿主对病原微生物的易感性，这给水产养殖业造成了极大的经济损失。酚氧化酶原激活系统（proPO-AS）是甲壳动物高效的免疫识别系统，其活性的变化与机体的抗病能力密切相关。但目前，重金属Cu2+胁迫是如何调控proPO-AS的及其可能的机制尚不明确。
　　本研究以克氏原螯虾为实验对象，重金属Cu2+为胁迫因子，采取96 h静态急性染毒实验，获得到克氏原螯虾的半致死浓度LC50=22.14 mg·L-1。根据LC50分别设置1.0,3.0,5.0和10.0 mg·L-1（近似于1/20,1/7,1/4和1/296h-LC50）4个Cu2+染毒组，并设1个空白对照组。在染毒24 h、48h、72 h和96 h后，分别采集血淋巴液、鳃和肝胰腺等组织，检测Cu2+胁迫对氧化应激指标（ROS、SOD、GSH-Px、PCO和DPC等）及主要免疫指标（Hc、THC、pro-PO、PO和SP等）的影响，并利用主成分分析的统计方法，分析血淋巴液中各指标之间的相关性，旨在为甲壳动物的免疫毒性学研究提供理论依据。实验结果表明：
　　（1）随着Cu2+染毒剂量与时间的增加，螯虾的鳃、血清、肝胰腺组织中ROS含量显著上升；鳃组织的SOD活性显著下降，当Cu2+浓度高于5.0 mg·L-1时，血清SOD活性显著下降，肝胰腺的SOD活性呈现了先上升后下降的趋势。整个实验期间，各组织中的GSH-Px活性均为先上升后下降。同时，鳃、血淋巴、肝胰腺中PCO含量均显著上升；鳃、肝胰腺组织的DPC系数逐渐上升，血淋巴的DPC系数在3.0 mg·L-1Cu2+时达到最大，但其他处理组变化不明显。这些结果表明，Cu2+胁迫导致机体ROS含量上升，抗氧化酶GSH-Px与SOD活性显著下降，DPC与PCO水平提高，对机体造成了氧化损伤，血淋巴是ROS损伤的主要靶组织之一。
　　（2）低浓度（1.0 mg?L-1）的Cu2+也具有免疫毒性，在染毒96 h后，随着浓度的增加，Cu2+能够抑制血淋巴中的血细胞数、血蓝蛋白含量与酚氧化酶活性，三者的变化规律基本一致，以10 mg?L-1Cu2+最为显著。当浓度最高达10 mg?L-1时，Cu2+还会抑制proPO-AS中的酚氧化酶原、酚氧化酶、丝氨酸蛋白酶活性，Cu2+可能参与了proPO-AS的调控。螯虾血细胞及其胞内外的蛋白成分，如血蓝蛋白、丝氨酸蛋白酶、酚氧化酶及其酶原，具有不同的生理作用与理化性质，Cu2+诱导的氧化应激可能通过不同的机制对其进行调控。
　　（3）根据主成分分析（PCA）结果分析，从9个氧化应激及免疫指标中提取出三个主成分，占总方差累积百分比达到78.40％。从初始因子载荷矩阵上可得，血清中ROS、血蓝蛋白含量、SOD、GPx、PO活性在第一主成分上具有较高载荷。DPC系数与PCO含量在第二主成分上具有较高载荷，血细胞裂解液中酚氧化酶原与丝氨酸蛋白酶活性在第三主成分上具有较高载荷。这表明 Cu2+胁迫下螯虾血淋巴中抗氧化指标GPx、SOD和免疫指标PO活性均与ROS含量具有较强的相关性；血细胞裂解液中酚氧化酶活性与丝氨酸蛋白酶活性呈现正相关；血蓝蛋白含量与PO活性呈正相关。利用生物信息学方法对克氏原螯虾血蓝蛋白及酚氧化酶原基因进一步分析，结果显示其具有相似的铜结合位点及活性区域，进一步表明血蓝蛋白可能具有酚氧化酶活性。
　　综上所述，重金属Cu2+对克氏原螯虾的proPO-AS具有抑制效应。其机制可能是：（1）Cu2+诱导产生氧化与抗氧化失衡，即ROS含量上升，而抗氧化酶SOD与GSH-Px活性下降，进而造成细胞的蛋白质羰基化和DNA损伤，抑制了proPO-AS主要成分的活性或合成；（2）Cu2+胁迫调节血细胞数（THC）以及血细胞中的pro-PO和丝氨酸蛋白酶活性、血清中的Hc水平，最终影响血清中的PO活性。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1.1水域环境中重金属污染的现状及危害

1.1.1水环境重金属污染现状

1.1.2水环境重金属污染的来源

1.1.3水生动物对重金属的吸收和积累

1.1.4重金属污染对水生生物的毒性效应

1.2甲壳动物抗氧化防御机制

1.3甲壳动物的免疫机制

1.4研究背景、目的与意义

1.4.1研究路线

第二章 重金属Cu2+胁迫对克氏原螯虾的氧化损伤效应

2.1材料与方法

2.1.1实验材料与仪器

2.1.2主要试剂的配制

2.1.3染毒方法

2.1.4样品处理

2.1.5氧化应激指标的测定

2.1.6 氧化损伤指标的测定

2.1.7数据处理与分析

2.2结果与分析

2.2.1 Cu2+胁迫对克氏原螯虾的氧化应激

2.2.2 Cu2+胁迫对克氏原螯虾的氧化损伤

2.3讨论

第三章 重金属Cu2+胁迫对克氏原螯虾酚氧化酶原系统的损伤

3.1材料与方法

3.1.1 实验材料与仪器

3.1.2 主要试剂的配制

3.1.3 染毒方法

3.1.4 样品处理

3.1.5 血淋巴中血细胞数目的测定

3.1.6 血清中血蓝蛋白（Hc）含量的测定

3.1.7 酚氧化酶原激活系统活力的测定

3.1.8数据处理与分析

3.2结果与分析

3.2.1 Cu2+胁迫对螯虾血细胞数目的影响

3.2.2 Cu2+胁迫对螯虾血清中血蓝蛋白（Hc）含量的影响

3.2.3 Cu2+胁迫对克氏原螯虾酚氧化酶原激活系统活力的影响

3.3讨论与结论

第四章 重金属Cu2+对克氏原螯虾免疫损伤的机制研究

4.1研究工具与方法

4.2结果与讨论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人情况及联系方式

声明