错配修复蛋白Mlh3在嗜热四膜虫有性生殖中的功能分析

摘要

DNA错配修复（MMR）是进化上保守的机制，它能够去除DNA复制或者损伤过程中引起的突变，矫正复制过程中产生的错配碱基，从而维持基因组复制的准确性。在大肠杆菌细胞中，MMR系统包括 MutS， MutL，MutH等。酵母和哺乳类的MMR系统中有6个MutS同源物(MSH1，MSH2，MSH3，MSH4， MSH5，MSH6)，4个MutL的同源物( PMS1，MLH1， MLH3，酵母MLH2/哺乳类PMS2)。在E.coli中，MMR蛋白MutS以同源二聚物的形式发挥功能，它的作用是识别发生错误配对的核苷酸链。在 ATP的水解作用下， MutS二聚物结合到 DNA链上，形成滑动夹，在 DNA链上滑动并募集另一种修复蛋白 MutL，进而将 MutH招募到错配位点附近，并激活其核酸酶活性，在错配位点附近切断错配碱基所在的DNA链。真核生物 MutL同源物有三种，其组成分别为 MutLα(MLH1/ PMS2)、MutLβ(MLH1/MLH1)和MutLγ(MLH1/MLH3)。MutL是DNA修复系统中的关键组分，它的缺失瓦解了MMR系统，使DNA不能正常修复，大大增加了编码基因的错义突变和移码突变频率。MutLγ具有核酸内切酶的活性，减数分裂联会阶段，参与非姊妹染色单体之间的重组和交换过程。小鼠MLH3基因的缺失会导致不孕不育。
　　嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)在饥饿条件下，启动有性生殖。小核进行减数分裂，三个减数分裂产物降解，第四个进行合子前的有丝分裂。配对细胞交换配子核，当四膜虫各自的一个配子核移动到与它配对的四膜虫中，与相应未移动的配子核发生融合，受精发生。合子核经历2次合子后的核分裂产生四个核，其中两个发育成新的大核（大核原基），另外两个发育成新小核。经过染色体程序化断裂、DNA删除和基因组复制等过程，新大核原基形成新的多倍体大核。在减数分裂时期，减数分裂特异的核酸酶 Spo11引起双链DNA断裂，小核拉伸进行同源染色体配对，错配修复蛋白 MutS（Msh4和 Msh5）促进同源染色体交叉的形成，解离酶 Mus81和解旋酶Sgs1促使同源染色体分离。MLH1的敲除并未引起小核减数分裂可见的异常。MutLγ在小核减数分裂染色体修复、新大核基因组重排修复中的作用并不清楚。
　　本研究首次从嗜热四膜虫中鉴定出有性生殖特异表达的错配修复基因 MLH3，并对其在四膜虫有性生殖发育中的功能做了系统分析，获得以下结果：
　　1．MLH3基因的鉴定与分析
　　本研究通过cDNA末端快速扩增法，获得长度1189 bp的cDNA，开放阅读框为960 bp，5′UTR距离ATG为18 bp，3′UTR为211 bp， polyA尾长为48 bp，预测编码319个氨基酸。Blast分析表明（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）Mlh3含有进化上保守的具有内切核酸酶活性的Mn离子结合位点DQHA(X)2E(X)4E。Microarray表达谱表明MLH3是有性生殖期特异表达基因(http://tfgd.ihb.ac.cn)。
　　2．Mlh3定位在生殖核和新发育的大核
　　为了分析Mlh3在四膜虫中的定位，本研究首先构建了带有HA标签的重组质粒pXS75-MLH3和带有红色荧光蛋白mCherry标记的重组质粒，转化入四膜虫，经巴龙霉素（PM）浓度梯度的筛选，获得 HA-MLH3和 mCherry-MLH3重组细胞株。间接免疫荧光定位显示 HA-Mlh3在有性生殖早期定位于小核中，在Anlagen时期定位于新发育的大核中，在发育的晚期，定位消失。活细胞定位显示HA-Mlh3有性生殖中定位于小核。结果表明Mlh3可能参与了小核和新大核的发育进程。
　　3．敲除MLH3影响有性生殖核发育进程
　　为了分析MLH3的功能，构建并获得MLH3完全敲除的突变细胞株。在有性生殖发育早期，MLH3敲除突变体细胞并没有明显发育异常；在发育后期，当55％的野生型细胞发育成两大核一小核的单细胞状态时，MLH3敲除突变细胞中，20%保留在配对的大核原基阶段，45%在两大核两小核阶段，并未出现1个小核和2个大核状态的单细胞；48 h时，70%野生型细胞发育到两大核一小核阶段，而MLH3敲除突变配对细胞消失，仅保留1个生殖核和1个营养核的没有配对的单细胞。
　　4．敲除MLH3影响新大核基因组复制和修复
　　MLH3敲除细胞有性生殖后期发育异常。为了分析可能的原因，分析了发育中大核基因组的断裂修复和内部复制。γ-H2AX免疫荧光定位表明，在新大核发育时期，MLH3敲除突变体细胞除了在新发育的大核存在断裂信号，在小核中也检测到定位信号。推测小核基因组中存在未被修复的断裂片段。在发育到后期，MLH3敲除突变细胞的新大核和新小核中荧光定位信号并未消失，表明DNA断裂仍未修复。5．MLH3敲除导致有性生殖后代不能存活
　　为了进一步证实 MLH3敲除影响了后代发育，进行了后代存活率检测。结果发现，敲除 MLH3之后，接合生殖产物并不是真正的后代。流式细胞检测表明，正常细胞有性生殖发育成两大核一小核阶段，MLH3敲除细胞却出现凋亡迹象。
　　本课题首次从嗜热四膜虫中鉴定出一种错配修复基因MLH3，构建并获得了它的过表达细胞株和敲除突变稳定株。HA标签固定细胞定位和mCherry标签活细胞定位显示：在接合生殖前期，Mlh3特异性的定位在小核中，在大核发育时期，新大核上也有Mlh3的定位。MLH3敲除之后，四膜虫接合生殖进程受到影响，并且不能产生真正的可育后代，在接合生殖后期，新发育的大核和小核存在DNA断裂损伤，并且不能修复，细胞发生裂解。由此可见，在接合生殖过程中，嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3是必不可少的。

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封面

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英文摘要

第一章文献综述

1.1 错配修复蛋白MMR研究进展

1.2 错配修复蛋白Mlh3研究进展

1.3 四膜虫概述

1.4 本课题的研究意义

第二章 嗜热四膜虫MLH3基因的鉴定及序列分析

2.1 前言

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果

2.5 讨论

第三章 Mlh3在嗜热四膜虫中的定位分析

3.1 前言

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果

3.5 讨论

第四章 Mlh3对四膜虫有性生殖是必需的

4.1 前言

4.2 材料

4.3 方法

4.4 结果

4.5 讨论

总结与展望

总结

展望

参考文献

附录Ⅰ

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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