大白菜半胱氨酸脱巯基酶突变植株的构建

摘要

硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S)是继一氧化氮和一氧化碳之后第三种气体信号分子，在植物体的生长发育和抵御外界胁迫过程中发挥着重要的作用。近年来，环境污染日益严重，对大白菜的生长发育过程产生严重的抑制作用。半胱氨酸脱巯基酶(DES1和LCD)是产生H2S的关键酶，将DES1和LCD基因整合入大白菜基因组，有可能提高其抗逆性，同时为白菜育种提供新种质。另外，CRISPR/Cas9被认为是第三代基因组编辑技术，具有较高的基因编辑效率，利用CRISPR/Cas9技术将白菜中半胱氨酸脱巯基酶基因功能敲除，可为研究H2S信号在大白菜中的生理功能提供理论基础以及为后续研究提供突变体材料。
　　本实验以大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensi)自交系“矮青1号”为材料，在本课题组已有的培养转化体系基础上对种子的消毒时间、菌液侵染时间以及抗生素筛选压进行优化，获得有效的转化体系，同时构建了DES1、LCD过表达载体和LCD缺失突变载体，并利用农杆菌介导的遗传转化法成功获得了遗传转化植株，本文主要研究结果如下:
　　1.过表达载体的构建:用限制性内切酶NcoⅠ-HF和EcoRⅠ-HF双酶切载体pET-28a-DES1和XF-246，BamHⅠ-HF和SalⅠ-HF双酶切载体pET-28a-LCD和pCAM2300，将具有相同粘末端的酶切产物进行连接后转化大肠杆菌DH5α，得到过表达载体XF-246-DES1和pCAM2300-LCD，通过酶切和PCR鉴定证明重组载体构建成功，并成功转化到农杆菌LBA4404。
　　2.缺失突变载体的构建:争对大白菜LCD基因设计了20bp靶点，化学合成该序列，并将其克隆到中间线性载体AtU6-26-sgRNA-SK中，酶切和测序鉴定正确。然后用NheⅠ-HF和SpeⅠ-HF双酶切重组载体AtU6-26-sgRNA-SK-LCD，得到sgRNA cassette片段，同时用SpeⅠ-HF单酶切载体pYAO，将基因片段与线性载体片段回收连接后转化DH5a，得到缺失突变载体pYAO-LCD，经酶切鉴定正确，并成功转化了农杆菌LBA4404。
　　3.大白菜遗传转化体系的优化:用0.1％的HgCl2对种子消毒6min，既能保持较高的萌发率又能防止内源菌的产生;用OD600为0.2～0.3的菌液侵染外植体5min，分别以7.5mg·L-1和5.0mg·L-1的潮霉素作为抗性芽和根的抗生素筛选浓度，转化效率较高，过表达载体XF246-DES1转化大白菜的转化率为10％;过表达载体pCAM2300-LCD的转化率为8％;CRISPR/Cas9敲除突变载体pYAO-LCD的转化率为13.3％。
　　4.转基因植株的检测:通过qRT-PCR检测了阳性植株中转化目的基因的表达量以及利用四通道自由基分析仪测定了转基因植株中H2S含量，结果显示:DES1和LCD过表达植株中DES1和LCD的表达量显著提高，且H2S含量极显著升高;LCD缺失突变植株(lcd)中，LCD靶点序列发生了碱基替换，说明CRISPR/Cas9基因编辑系统对白菜LCD基因进行了定点编辑。
　　综上所述，本研究通过构建过表达载体XF-246-DES1和pCAM2300-LCD、缺失突变载体pYAO-LCD、优化遗传转化体系，成功构建了适合“矮青1号”的高效遗传转化体系和DES1和LCD过表达突变体以及LCD缺失突变体。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物体内硫化氢的产生及生理功能

1．2 大白菜遗传转化研究概况

1．3 影响大白菜遗传转化的因素

1．3．1 基因型

1．3．2 苗龄及外植体类型

1．3．3 接种方式

1．3．4 预培养和共培养

1．3．5 菌液浓度及菌液侵染时间

1．3．6 抗生素筛选剂

1．4 白菜类蔬菜转基因现状

1．4．1 非生物胁迫相关基因

1．4．2 生物胁迫相关基因

1．4．3 其它基因的转化

1．5 大白菜品种改良遗传转化方法

1．6 CRISPR／Cas9基因编辑技术的研究进展

1．6．1 CRISPR／Cas9编辑技术概述

1．6．3 CRISPR／Cas9基因编辑检测方法

1．7 本课题研究的目的、内容和意义

第二章 半胱氨酸脱巯基酶编码基因转化载体的构建

2．1 试验材料

2．1．1 质粒和菌株

2．1．2 酶和试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 培养基与溶液

2．2 试验方法

2．2．1 过表达载体XF-246-DES1的构建及鉴定

2．2．2 过表达载体pCAM2300-LCD的构建及鉴定

2．2．3 敲除突变载体pYAO-LCD载体的构建及鉴定

2．3 结果与分析

2．3．2 pCAM2300-LCD过表达载体的构建和转化

2．3．3 pYAO-LCD敲除突变载体的构建和转化

第三章 大白菜遗传转化体系的优化

3．1 试验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 培养基

3．2 试验方法

3．2．1 遗传转化基本过程

3．2．2 转化体系有关因素的优化

3．3 结果与分析

3．3．1 种子消毒时间的优化

3．3．2 不同浓度潮霉素对大白菜不定芽生长的影响

3．3．3 不同浓度的潮霉素对大白菜不定根的影响

3．3．4 侵染时间的筛选

3．3．5 转基因植株的获得

3．4 讨论与结论

第四章 大白菜转基因植株的检测

4．1 试验材料

4．1．1 植株材料

4．1．2 主要试剂

4．2 试验方法

4．2．1 PCR

4．2．2 植株基因组DNA和RNA的提取及反转录

4．2．3 内源H2S含量的测定

4．2．4 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 DES1过表达植株的检测

4．3．2 LCD过表达植株的检测

4．3．3 LCD敲除突变植株的检测

4．4 讨论与结论

结论

展望

参考文献

附录

硕士期间发表的论文

致谢

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