PCSK6对类风湿关节炎和胶原诱导性关节炎滑膜细胞生物学的作用及分子机制研究

摘要

目的:1.探讨siRNA沉默PCSK6基因对胶原诱导性关节炎(CIA)成纤维样滑膜细胞(FLS)生物学行为的影响。2.探讨外源性 PCSK6重组蛋白对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞生物学行为的影响及其分子机制。
　　方法:1.采用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠CIA模型，取膝关节滑膜组织原代培养FLS；采用人工合成的大鼠PCSK6特异siRNA特异性抑制PCSK6在CIA FLS中的表达，以negative siRNA为阴性对照组，瞬时转染24 h、36 h，采用RT-qPCR法检测抑制效率，同时检测PCSK6基因沉默后各相关基因的表达；采用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、ELISA等方法检测干扰PCSK6表达后对大鼠CIA FLS增殖、侵袭、迁移、细胞周期和相关炎性因子分泌的影响。2.采用PCSK6重组蛋白诱导RA FLS，采用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、ELISA等方法检测PCSK6重组蛋白对RA FLS增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡以及相关炎性因子分泌的影响；采用RT-qPCR法检测PCSK6重组蛋白刺激后各相关基因的表达；采用Western blot法检测PCSK6重组蛋白对基质金属蛋白酶MMP9以及ERK、STAT3、Wnt3a、Nodal、mTOR、NF-κB p65、NF-κB p105/p50信号转导通路的影响。采用通路抑制剂PD98059、Stattic、PDTC分别抑制ERK、STAT3、NF-κB p65通路，与PCSK6重组蛋白共同作用于RA FLS，利用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、ELISA等方法检测ERK、STAT3、NF-κB p65通路抑制剂对PCSK6重组蛋白诱导的RA FLS增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡以及相关炎性因子分泌的影响。
　　结果:1.转染特异性siRNA-PCSK6后，干扰组与阴性对照组相比，PCSK6 mRNA水平明显被抑制(P<0.001)，CIA FLS的增殖受到抑制(P<0.001)，细胞的侵袭和迁移能力下降(P<0.001)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)分泌降低(P<0.001)，G0/G1期的细胞数目增多(P<0.05)，PCSK6下游基因 CXCL9、MMP2、MMP9、NOSTRIN、HIF-1α、MPZL2、IGF2、PADI4表达均明显下降(P<0.05)。2. PCSK6重组蛋白诱导RA FLS后，与空白对照组相比，150ng/mL PCSK6重组蛋白促进效果最显著，能使RA FLS的增殖速率显著提高(P<0.01)，细胞的迁移和侵袭能力加强(P<0.001)，IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α分泌均升高(P<0.05)，S期和G2/M期的细胞数增多(P<0.01)，细胞晚期凋亡率减少(P<0.01)，PCSK6下游基因C10ORF116、CXCL9、CXCL10、HIF-1α、IL-6、IL-10、IL-26、MMP9、NOSTRIN、TNF-α表达均明显升高(P<0.001)，MMP9前体和成熟的蛋白量均升高，诱导6h时可显著激活FLS中的ERK、STAT3、NF-κB p65信号转导通路。加入通路抑制剂PD98059、Stattic和PDTC后，150ng/mL PCSK6重组蛋白诱导的RA FLS的增殖(P<0.05)、迁移(P<0.001)、侵袭(P<0.001)、炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α)分泌(P<0.05)均受到抑制；通路抑制剂Stattic和PDTC可以逆转PCSK6重组蛋白对细胞周期的诱导(P<0.05)；通路抑制剂PDTC可以逆转PCSK6重组蛋白对FLS的细胞凋亡的影响(P<0.05)。
　　结论:1.内源性PCSK6基因沉默对CIA FLS的生物学行为具有一定抑制作用，为进一步研究CIA发病机制奠定基础。2.外源性PCSK6重组蛋白对RA FLS的增殖、迁移、侵袭和炎症因子分泌等生物学行为具有一定促进作用；PCSK6通过参与ERK、STAT3、NF-κB p65信号转导通路来调控RA FLS的生物学行为。PCSK6可以作为研究RA发病机制、药物筛选以及免疫治疗的新靶点。

目录

声明

主要符号表

第一部分 引 言

第二部分 PCSK6沉默对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞生物学的影响

1实验材料

1.1实验动物

1.2主要试剂

1.3主要仪器

2研究方法

2.1 CIA模型构建

2.2滑膜细胞原代培养

2.3滑膜细胞纯度鉴定

2.4细胞顺势转染

2.5细胞RNA提取

2.6采用RT-qPCR法检测干扰PCSK6抑制效率及PCSK6下游功能基因的表达

2.7采用MTT法检测细胞增殖能力

2.8采用流式细胞术检测细胞周期变化

2.9采用划痕法检测细胞迁移能力

2.10采用Transwell法检测细胞侵袭能力

2.11采用ELISA法检测细胞炎性因子的分泌水平

2.12统计学处理

3实验结果

3.1大鼠后爪肿胀程度

3.2滑膜细胞形态观察及纯度鉴定

3.3 siRNA特异性抑制对PCSK6基因的影响

3.4抑制PCSK6表达对滑膜细胞增殖、迁移和侵袭的影响

3.5 ELISA检测抑制PCSK6表达对细胞炎性因子的影响

3.6流式细胞术检测抑制PCSK6表达对滑膜细胞周期的影响

3.7 PCSK6基因沉默对下游相关功能基因表达的影响

4讨论

第三部分 PCSK6 重组蛋白对类风湿关节炎滑膜细胞生物学的影响及分子机制研究

1实验材料

1.1样本采集

1.2主要试剂

1.3主要仪器

2研究方法

2.1滑膜细胞原代培养

2.2滑膜细胞纯度鉴定

2.3 PCSK6重组蛋白浓度梯度制备

2.4采用MTT法检测细胞增殖能力

2.5采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化

2.6采用划痕法检测细胞迁移能力

2.7采用Transwell法检测细胞侵袭能力

2.8采用ELISA法检测细胞炎性因子的分泌水平

2.9细胞RNA提取

2.10采用RT-qPCR法检测PCSK6下游功能基因的表达

2.11采用Western blot法检测PCSK6重组蛋白诱导后相关信号转导通路的变化

2.12抑制信号转导通路后PCSK6对滑膜细胞生物学行为的影响

2.13 统计学处理

3实验结果

3.1滑膜细胞形态观察及纯度鉴定

3.2 PCSK6重组蛋白对滑膜细胞增殖、迁移和侵袭的影响

3.3 ELISA法检测PCSK6重组蛋白对滑膜细胞炎性因子分泌的影响

3.4 RT-qPCR法检测PCSK6重组蛋白对下游相关功能基因表达的影响

3.5流式细胞术检测PCSK6重组蛋白对滑膜细胞周期和凋亡的影响

3.6 Western blot法检测PCSK6重组蛋白对基质金属蛋白酶MMP9的影响

3.7 PCSK6重组蛋白对ERK、STAT3、NF-κB p65等信号转导通路的影响

3.8 ERK、STAT3、NF-κB p65信号通路抑制剂对滑膜细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

3.9 ELISA法检测ERK、STAT3、NF-κB p65信号通路抑制剂对细胞炎性因子分泌的影响

3.10流式细胞术检测ERK、STAT3、NF-κB p65信号通路抑制剂对滑膜细胞周期和凋亡的影响

4讨论

参考文献

附录

综述:类风湿关节炎易感基因的全基因组关联分析研究概述

攻读硕士学位期间取得的成果

致谢