弓形虫SAG2、GRA6、GRA7基因的重组表达及应用研究

摘要

研究背景与目的：弓形虫(Toxopasma gondii)是严重影响健康的机会致病原虫。能在人类与家畜之间传播，呈世界性分布。它可侵犯除健康成熟红细胞以外的有核细胞，引起多器官组织的病变。对于正常人群，机体免疫力正常，则感染弓形虫后常为无症状带虫状态，然而对于特殊人群如当患有艾滋病、结核、肿瘤、器官移植后等免疫功能受损或抑制时，弓形虫就机会性感染引起明显的临床症状，甚至死亡。若孕妇患有弓形虫感染可引起胎儿畸形及流产，严重者可出现死胎。在家禽之间的传播导致大量家禽的死亡，造成严重的经济损失。因而预防弓形虫病的发生，早期诊断弓形虫病具有很大的临床价值。然而弓形虫寄生于宿主细胞内，直接取弓形虫病原体困难，而临床表现无特异性，单靠临床诊断非常困难。目前常用的方法有病原学、免疫学和分子生物学，每种方法各有优缺点。病原体直接镜检是传统方法，特异性高但容易漏诊，不能适应临床需要。免疫学诊断方法敏感性及特异性高，操作相对便捷，所以应用免疫学方法诊断弓形虫病更为重要。随着近几年分子生物学的发展，将有诊断价值的弓形虫抗原分子克隆到原核或真核表达载体，进行表达、纯化，从而获得高纯度抗原，特异性高，应用广泛。 SAG2是表面抗原蛋白，GRA6、GRA7是致密颗粒蛋白，具有较强的抗原性和免疫原性。本研究首先构建了弓形虫的 RH株 SAG2、GRA6和 GRA7基因的重组质粒pGEX-4T-SAG2、pGEX-4T-GRA6和pGEX-4T-GRA7，并将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21，然后用IPTG体外诱导表达目的蛋白，纯化的蛋白作为包被抗原，对358份人源血清进行ELISA检测，为SAG2、GRA6和GRA7作为人、兽弓形虫病诊断抗原的研究奠定基础。
　　方法：1．目的基因的扩增从弓形虫感染的小鼠腹水中提取RH株的基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳鉴定纯化回收。2．重组质粒的构建将PCR产物及载体pGEX-4T分别进行双酶切(EcoRI、BamHI)，通过回收试剂盒回收酶切片段，将获取的目的片段与载体进行连接，将连接产物转化入E.coli TOP10感受态细胞。酶切鉴定后送基因公司测序。3.重组质粒的表达和纯化IPTG体外诱导表达，利用His-bindTM柱柱纯化融合蛋白，SDS-PAGE和免疫印迹分析。
　　结果：1. PCR特异地扩增出目的基因，SAG2、GRA6和GRA7扩增产物经电泳鉴定，大小分别为561、693和714bp，长度与理论值相符。2.重组质粒经EcoRI、BamHI双酶切，电泳显示在相应位置出现条带，与预期大小（561、693和714bp）一致。对酶切鉴定正确的重组质粒进行送样测序，测序结果经比对后与原始序列同源性100％，表明成功构建了重组质粒。3.采取各组份样品，进行 SDS-PAGE分析，电泳显示在相应位置（47KD、52KD、53KD）出现明显条带，表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7成功得到了表达，表达主要方式为包涵体表达。4.融合蛋白经过免疫印迹分析，在相应位置（47KD、52KD、53KD）出现明显条带，表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7表达正确。5.利用纯化的蛋白作为包被抗原，对人源358份血清的弓形虫IgG抗体检测，阳性率为3.07%-4.75%。进口的弓形虫诊断试剂盒对检测阳性的样本复检符合率为100%，48份阴性血清进行平行检测，结果均为阴性，与ELISA结果相符。

目录

声明

主要符号表

引言

1 弓形虫及弓形虫病概况

2 弓形虫病免疫诊断方法研究现状

3 本研究的目的及意义

第一部分 弓形虫SAG2、GRA6、GRA7基因原核表达载体的构建

材料

方法

结果

讨论

第二部分 弓形虫SAG2、GRA6、GRA7基因的表达及鉴定

材料

方法

结果

讨论

第三部分 SAG2、GRA6和GRA7重组抗原的应用研究

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:应用重组抗原诊断弓形虫病的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢