蝎毒多肽提取物通过MICA-NKG2D途径调控肝脏移植瘤中浸润自然杀伤细胞活性的机制

摘要

目的：
　　自然杀伤(Natural killer,NK)细胞是机体固有免疫系统重要组成部分，在肝脏、肺脏等免疫器官中含量丰富，而且与外周NK细胞相比其免疫表型、功能等表现出器官特异性。在正常情况下，NK细胞表面的活化性受体与靶细胞表面的配体直接结合并通过释放细胞毒性物质，诱导活化靶细胞凋亡程序，从而发挥抗感染、抗肿瘤作用。MICA/NKG2D是NK细胞活化的主要信号通路，在NK细胞活化及诱导杀伤靶细胞中发挥重要作用。然而在肿瘤发生过程中，肿瘤细胞仍能够通过多种途径逃避机体的免疫监视功能，研究认为肿瘤细胞抗原异常表达、肿瘤微环境中细胞因子及其他免疫细胞相互作用等因素所引起的NK细胞活性降低对于诱导肿瘤免疫逃逸的发生起了重要作用。因此，提高NK细胞活性，增强其对肿瘤细胞的杀伤识别及清除作用被视为抵抗肿瘤免疫逃逸，抑制肿瘤增殖的重要渠道。
　　我们在前期研究发现：蝎毒多肽提取物（polypeptide extract from scorpion venom， PESV）对多种肿瘤细胞具有抑制作用，并通过抑制肿瘤微血管生成、调节巨噬细胞和树突状细胞抗原提呈，参与对肿瘤细胞的清除，但 PESV对天然免疫细胞尤其是肝脏NK细胞在抗肿瘤中的调节辅助作用尚未有相关研究，能否改善NK细胞在肿瘤患者及荷瘤小鼠中的免疫抑制效应是我们关注研究的重点。在此基础上，观察PESV对于肝癌的相关抑制作用以及肿瘤微环境中NK细胞的活化的调节作用机制，为进一步探讨PESV调节机体天然免疫、抗肿瘤活性提供新策略。
　　方法:
　　1.PESV对人肝癌细胞HepG2细胞和正常人外周淋巴细胞PBLs活性的影响：采用MTT法检测不同浓度PESV对细胞活性的影响；流式细胞术检测PESV对HepG2细胞周期的影响。
　　2.流式细胞术检测各药物干预组对HepG2细胞表面mMICA表达比例。
　　3.LDH细胞毒性检测法检测NK细胞对PESV干预组HepG2细胞的杀伤作用：无菌分离正常人外周血 NK细胞作为效应细胞，以不同药物处理组 HepG2细胞作为靶细胞，按不同效靶比共同培养4h，采用LDH细胞毒性检测NK细胞杀伤功能。
　　4.采用直接注射法构建 H22肝癌原位移植瘤小鼠模型，术后随机分为荷瘤对照组（Control），PESV低剂量组（PESV-L，10mg/ml）和PESV高剂量组(PESV-H,40mg/ml)，另选取正常非手术小鼠为正常对照组(Normal)，分别给予PESV和生理盐水连续灌胃14天后处死小鼠取肝肿瘤组织测量肿瘤体积和肿瘤质量，计算抑瘤率。另取同样建模处理小鼠给予14天用药干预后停药并观察其荷瘤生存期。
　　5.采用HE染色观察肝脏肿瘤组织病理变化。
　　6.采用流式细胞术检测小鼠肝脏、脾脏中CD3-NK1.1+细胞及其表面NKG2D的表达。
　　7.采用免疫组织化学法检测肝脏肿瘤组织中NK1.1+细胞的浸润。
　　8.实时定量PCR法检测肝脏肿瘤组织中穿孔素、颗粒酶B mRNA表达。结果:
　　1.PESV抑制HepG2细胞活性
　　MTT结果显示：PESV能够明显抑制HepG2细胞的活性，抑制作用呈剂量依赖性，而对PBLs细胞活性没有明显影响；细胞周期结果显示PESV能显著提高G1期HepG2细胞所占比例，使细胞增殖停滞在G1期（P<0.05）。
　　2.PESV显著提高HepG2细胞表面mMICA的表达，增强NK细胞的杀伤活性
　　流式细胞术结果显示不同剂量PESV作用细胞24h后HepG2细胞表面mMICA的表达显著提高（P<0.05），与不同效靶比的 NK细胞共培养后 NK细胞的杀伤活性显著提高（P<0.05）。采用抗MICA抗体封闭后，NK细胞杀伤活性显著降低，PESV未见显著增强作用。
　　3.PESV抑制H22原位移植瘤小鼠肿瘤生长，延长荷瘤生存期
　　PESV大、小剂量组肝脏移植瘤的生长均受到抑制，肿瘤体积和瘤质量均低于荷瘤对照组（P<0.05），肿瘤抑制率分别为30.77％和15.38%。生存期观察显示PESV大剂量组能显著延长荷瘤小鼠生存时间，生命延长率为34.06%（P<0.05）；组织病理学结果显示荷瘤对照组肝脏肿瘤细胞排列紧密，异型性显著，呈浸润性生长，PESV大、小剂量组出现明显坏死区，细胞异型性减轻。
　　4.PESV提高荷瘤小鼠肝脏及脾脏NK细胞浸润，促进其表面活化性受体NKG2D的表达
　　流式细胞术结果显示，与正常对照组相比，荷瘤对照组小鼠肝脏及脾脏NK细胞所占总淋巴细胞的频数显著降低，NKG2D表达显著下调（P<0.05），提示NK细胞出现免疫抑制；而PESV大剂量组小鼠肝脏NK细胞占肝脏总淋巴细胞的比例显著高于荷瘤对照组（P<0.05），同时脾脏 NK细胞比例也显著提高（P<0.05），NK细胞表面的活化性受体NKG2D表达在PESV组均显著增高（P<0.05），有利于NK细胞杀伤活性的提高。免疫组化染色结果显示，给予 PESV处理后 NK细胞在肿瘤组织中浸润程度显著增加（P<0.05），且主要分布在癌旁组织中，肿瘤坏死区域也可见少量分布。
　　5.PESV提高NK细胞毒性颗粒的表达
　　实时定量PCR结果显示，PESV大剂量组肿瘤组织中穿孔素和颗粒酶B的mRNA表达量分别是荷瘤对照组的3.62倍和5.82倍（P<0.05），表明PESV能显著提高肿瘤组织中穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达。
　　结论:
　　1.PESV调节HepG2细胞周期抑制细胞增殖;
　　2.PESV通过提高肿瘤细胞表面MICA的表达，增强NK细胞对其杀伤活性;
　　3.PESV抑制小鼠肝脏原位移植瘤的生长，延长生存时间;
　　4.PESV提高肝脏及脾脏NK细胞浸润，增强对肿瘤细胞的杀伤作用;
　　5.PESV通过MICA-NKG2D途径调节NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

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前言

实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞及实验动物

1.1.2 实验仪器

1.1.3 实验试剂

1.2实验方法

1.2.1 HepG2细胞的培养

1.2.2 MTT检测PESV对HepG2细胞和正常人外周血淋巴细胞（PBLs）活性的影响

1.2.3流式细胞术检测PESV对HepG2细胞周期的影响

1.2.4流式细胞术检测PESV对HepG2细胞膜MICA表达的影响

1.2.5乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞杀伤活性

1.2.6小鼠肝癌原位移植瘤模型的建立、分组及给药

1.2.7标本处理及荷瘤小鼠生存期观察

1.2.8 HE染色及肿瘤组织形态学观察

1.2.9流式细胞术检测肝脏及脾脏组织NK细胞及其受体NKG2D的表达

1.2.10免疫组化法检测肿瘤组织NK1.1阳性细胞的浸润

1.2.11 real-time PCR法检测癌及癌旁组织中穿孔素、颗粒酶BmRNA的表达

1.2.12统计学处理

实验结果

2.1 PESV抑制肿瘤细胞增殖，调节细胞周期

2.2 PESV上调mMICA表达提高NK细胞杀伤活性

2.2.1 PESV上调HepG2细胞mMICA的表达

2.2.2 PESV增强NK细胞对HepG2细胞杀伤毒性

2.3 PESV的抑瘤作用及对荷瘤小鼠的生存期影响

2.4 PESV对原位移植瘤组织病理学变化的影响

2.5 PESV对移植瘤组织及脾脏浸润NK频数的影响

2.6 PESV对移植瘤组织中浸润NK细胞分布的影响

2.7 PESV对NK细胞活化性受体NKG2D的表达变化的影响

2.8 PESV对移植瘤组织中穿孔素、颗粒酶B mRNA表达变化的影响

讨论

结论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢