栉孔扇贝（Chlamys farreri）大规模死亡病原—AVND病毒单克隆抗体的制备及检测技术研究

摘要

利用蔗糖密度梯度超速离心技术从自然发病的栉孔扇贝组织分离高纯度的AVND病毒粒子,并以此为抗原注射免疫Balb/c小鼠.将免疫小鼠的脾细胞与小鼠NS-1骨髓瘤细胞进行融合.经间接酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术和免疫荧光检测技术(immunofluorescence assay,IFA)对杂交瘤细胞进行筛选.最后筛选出10株与AVND病毒发生反应的阳性杂交瘤细胞株.其中,有4株细胞(2B3,3C8,3G7和4C7)在连续培养中能稳定传代并对该病毒具有较强的特异性反应.这4株单克隆抗体的亚型分别为IgG2b、IgG1、IgG2b和IgG2b.应用胶体金标记免疫电镜技术在超微水平上对这4株MAbs进行的测定表明,它们对AVND病毒均具有高度的特异性,并且所识别的特异性位点均位于病毒粒子囊膜的纤突上.进一步利用单克隆抗体建立了3种免疫学检测技术:间接ELISA、IFA和斑点免疫印迹(Dot-Immunoblot).其中,间接ELISA所能检测病毒蛋白的最低量约为5ng;适合于AVND病毒现场快速检测的Dot-immunoblot技术能适合于对稀释100倍的病贝组织匀浆液进行检测.应用间接ELISA检测技术对不同养殖季节(2003年4-10月)的一龄贝进行检测发现,7月中旬至8月底病毒感染率和感染强度均处于当年的最高峰,与流行病学调查中这一时期栉孔扇贝所表现出的高死亡率完全吻合.作为对照,组织学检测结果显示,患病扇贝各主要器官(外套膜、鳃、胃、肾等)的上皮组织可见显著的上皮细胞肿胀、嗜碱性增强、排列紊乱、部分脱落以至完全坏死脱落等广泛的组织病理学变化.进一步利用IFA技术对患病扇贝进行AVND病毒的原位检测发现,这种上皮组织的病理变化与病毒的感染之间具有一致的对应关系,如仅阳性细胞(荧光染色的细胞)呈现明显的病理改变;阳性细胞密度越高的部位,上皮细胞紊乱以及脱落的程度亦愈加严重.这一结果清楚地表明,AVND病毒的感染可以对栉孔扇贝这一宿主造成极其严重的组织结构上的病理性改变和损害,同时也说明,该病毒对栉孔扇贝具有极强的致病性.由此,首次为解释该病毒导致养殖中后期栉孔扇贝爆发性大规模死亡的机制及该病毒可能的传播途径提供了直接的组织病理学依据.

目录

摘要

ABSTRACT

前言

第一章AVND病毒单克隆抗体的制备及鉴定

第一节病毒的分离与纯化——抗原制备

1病料来源

2病毒的分离与纯化

3病毒提纯液的负染观察

4病毒提纯液蛋白质浓度的测定

第二节BALB/C小鼠的免疫

1免疫方案及操作

2脾内免疫

第三节细胞融合及杂交瘤细胞的培养

1主要试剂的配制

2小鼠骨髓瘤细胞的准备

3饲养细胞的制备

4免疫脾细胞悬液的制备

5细胞融合

第四节杂交瘤细胞的筛选

1病贝和健康贝的采集

2健康贝组织样品的处理

3间接酶联免疫吸附(ELISA)

4间接免疫荧光检测(IFA)

第五节杂交瘤细胞的单克隆化(有限稀释法)

第六节单克隆抗体的鉴定

1胶体金标记免疫电镜技术对MABS特异性结合位点的检测

2单克隆抗体亚型的测定

3小鼠腹水单克隆抗体的制备及纯化

4杂交瘤细胞培养上清液及腹水单克隆抗体的滴度测定

第七节结果

1病毒粒子的电镜负染观察

2骨髓瘤细胞的培养

3融合后的细胞在HAT筛选培养液中的培养

4杂交瘤细胞的筛选及单克隆化

5胶体金标记免疫电镜技术对MABS特异性结合位点的观察

6单抗的亚型、杂交瘤细胞培养上清液及腹水的滴度

7纯化腹水抗体的蛋白质浓度

第八节讨论

第二章AVND病毒免疫学检测技术的建立

第一节间接ELISA检测技术的建立及其检测的灵敏度

1腹水单抗稀释比例的确定

2间接ELISA检测的步骤

3 ELISA对AVND病毒检测的灵敏度

第二节IFA检测技术的建立

1样品采集

2 IFA检测参数的确定

3 IFA检测的具体步骤

第三节DOT-IMMUNOBLOT检测技术的建立

1操作步骤

2对病贝组织检测的灵敏度

第四节讨论

1间接ELISA检测

2 IFA检测

第三章AVND病毒感染栉孔扇贝的免疫学检测

第一节栉孔扇贝不同生长时期的ELISA检测

1材料与方法

2结果

第二节患病栉孔扇贝的组织病理学观察

1组织学切片制备及观察

2患病栉孔扇贝的组织病理学观察

第三节患病栉孔扇贝的IFA检测

1病毒感染的靶组织

2细胞病理学变化及组织结构的严重损害

3 AVND病毒在栉孔扇贝体内不同器官和组织的分布及特点

第四节电镜超薄切片技术对IFA检测组织的回顾性研究

1实验方法

2实验结果

第五节讨论

1不同生长季节栉孔扇贝AVND病毒感染率的ELISA检测

2患扇病贝的组织学和IFA检测

3 AVND的传播和致病机理

小结

参考文献

已完成的文章

致谢