用于毕赤酵母组成型表达的白斑综合征病毒（WSSV）VAP1基因的优化、克隆及大规模简易发酵技术初探

摘要

对虾白斑综合征病毒(WSSV)是危害全球对虾养殖业的主要病原微生物之一。自1992年以来，已经对该病毒及对虾白斑综合征进行了大量的研究。目前已经得到WSSV基因组全序列，从而为病毒功能基因的研究以及病毒侵染机理的研究奠定了基础。VAP1是定位在WSSV囊膜上的一个蛋白，由281个氨基酸组成，没有糖基化。通过试验论证，目前已经可以确认该蛋白是病毒侵入对虾细胞的一个重要的黏附蛋白。 本研究对VAP1基因进行了分析和设计改造，旨在通过基因的优化提高其在毕赤酵母中的表达量。改造的内容主要包括以下几方面： 1.选择毕赤酵母偏爱密码子，使得VAP1基因的密码子符合毕赤酵母在表达蛋白时对密码子的偏爱。 2.碱基含量调整，避免A+T富集。3酶切位点分析及密码子整。4酶的星号活性分析及密码子调整。5内含子分析及密码子调整。 3.在基因改造的基础之上，对改造后的基因VAP1part进行全基因合成，并将合成的基因克隆至酵母表达载体pGAPZαA，之后导入大肠杆菌DH5α进行重组质粒的筛选和保存。在通过PCR鉴定、酶切分析鉴定和DNA测序分析确定得到了所需的重组质粒之后，再将该质粒导入巴氏毕赤酵母，构建了重组毕赤酵母菌。 最后，本研究还就实验室简易扩大培养进行了初步的探讨。

目录

第一章引言

第一节白斑综合征病毒(WSSV)及基因组和结构蛋白研究概况

1白斑综合征病毒(WSSV)概述

2白斑综合征病毒(WSSV)基因组学及结构蛋白的研究

第二节毕赤酵母表达系统及影响其表达外源基因的因素

1巴氏毕赤酵母表达系统

2影响毕赤酵母表达外源基因的因素

参考文献

第二章白斑综合征病毒VAP1基因的改造及合成

第一节VAP1氨基酸序列功能和结构分析

1方法

2结果

3讨论

第二节VAP1part基因序列分析和改造及人工合成

1 VAP1part基因序列的分析和改造

2基因修改序列验证

3 VAP1part基因的人工合成

4讨论

参考文献

第三章白斑综合征病毒(WSSV)VAP1part基因的克隆及毕赤酵母工程菌的构建

第一节白斑综合征病毒(WSSV)VAP1part基因的亚克隆

1材料方法

2结果

3讨论

第二节白斑综合征病毒(WSSV)VAP1part基因在毕赤酵母中的分泌表达

1材料方法

2.结果

3讨论

第四章毕赤酵母实验室规模简易扩大培养装置及发酵效果初探

第一节发酵装置设计及基本操作

1设计构思

2解决方案

3基本结构流程

4操作流程

5结果

6讨论

第二节毕赤酵母实验室简易扩大培养

1材料设备

2方法

3结果

4讨论

参考文献

附录一本论文所使用的培养基和试剂配制

附录二发酵常用消泡剂及特点

附录三重组表达质粒的构建

致谢