南极海洋低温芳香烃降解菌的筛选、低温降解特性及其拉曼光谱的研究

摘要

南北极地区具有独特的地理及气候特征，除短暂的夏季部分地区有冰雪融化外，其余均被常年的冰雪所覆盖。变化极大的光照辐射、季节性的光照时间、极低的温度造就了极地微生物特殊的生物学特征。芳香烃（PAHs）是环境中持久存在的污染物，目前PAHs的生物降解和生物修复研究主要集中在常温条件下高效降解PAHs菌株筛选，微生物PAHs降解作用效果，PAHs的微生物降解机理等方面。极地海洋中的耐冷菌和嗜冷菌已经显现出修复当地多环芳烃污染的潜力，为低温环境中多环芳烃污染的生物修复提供了一种有效的办法。本实验从南极嗜冷菌以及南极低温石油烃降解菌中筛选得到低温芳香烃降解菌，将为我国北方海域春冬季芳香烃污染物的清除提供新的技术支持，同时对低温环境中芳香烃污染的生物修复具有重要的意义。 本实验通过平板菌落培养筛选以及MMC液体培养基培养筛选获得三株能够在低温条件下（0～10℃）降解芳香烃的南极低温细菌，对筛选到的三株南极低温降解菌进行平板生长和降解率试验；通过生物摇床进行单因素试验确定南极低温降解菌NJ41的最适营养和生长条件：通过萘、菲低温降解、混合菌株的降解试验、脱氢酶试验、酶的热稳定性试验、pH稳定性试验，对南极低温降解菌NJ41的降解特性和低温适应性进行研究，并首次将单细胞分子振动光谱新技术（拉曼光谱）应用于芳香烃微生物低温降解的研究，首次从单个细胞的水平以及细胞群体水平获得对南极细菌低温降解芳香烃的新认识。 主要获得以下结论：筛选出3株南极低温芳香烃降解菌NJ41、NJ49和NJ289，其均可以在以萘等芳香烃为唯一碳源的无机盐培养基中生长，并能够在低温环境（0～10℃）中高效的降解芳香烃，10℃条件下120 r/min，10 d时NJ41对于萘的降解能力最强为48．8％，NJ49和NJ289的降解能力相对稍弱，分别为43．5％和36．1％。温度对这三株细菌的降解能力有很大的影响，在10℃时NJ41具有最高的降解能力，温度升高降解能力下降，超过25℃则基本不具有降解能力；NJ49在15℃具有最高的降解能力，超过25℃没有降解能力；NJ289也在10℃时具有最高降解能力时，但超过20℃则不具备降解能力。 南极低温菌NJ41其最佳的生长温度为10℃，最适pH为7．5，盐度为6％，摇床转速为120 r/min，NJ41菌降解能力最强时萘的浓度为400 mg/L，并随着萘浓度的升高降解能力逐渐下降：最佳氮源为硝酸铵，添加微量元素能够促进萘的降解，但是微量元素的添加量超过一定量0．3％（V/V）后并不能促进萘的降解。一定含量的溶解氧有利于细菌NJ41的生长，因而可以加速萘的生物降解速率。NJ41对菲的降解能力为10℃条件下37．8％，NJ49对柴油的降解能力为15℃条件下达到68％，通过三株低温降解菌的混合降解萘的实验，发现混合菌群的降解能力并不是单一菌株降解能力的加和。 NJ41的脱氢酶在10℃～40℃之间时具有相对较高的酶活力，其中在30℃时酶活性最强。NJ41的粗酶液在10℃时较为稳定，保温10 h后仍能保持初活力的88％以上，随着温度的升高酶活力急剧下降，30℃时保温10 h后酶活力仅剩余20％。NJ41粗酶液降解萘的最适pH值为7．5，酶活力在pH值6．5～8．0之间较稳定，能保持最高酶活的70％以上。 初步推断南极低温芳香烃降解菌NJ41的拉曼光谱峰值所代表的物质，其中位于783 cm-1、812 cm-1处主要是磷脂类和油酸，1004 cm-1附近的峰主要代表物质是脂类，峰值1156 cm-1处代表的物质是葡聚糖类，1370 cm-1处是核苷酸类遗传物质，1435 cm-1和1516 cm-1处为蛋白质类。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 前言

1.1 海洋与海洋污染

1.1.1 海洋污染物的种类

1.1.2 海洋中的石油污染

1.1.3 合成有机化合物的污染

1.2 海洋中的持久性有机污染物

1.3 海洋中芳香烃的污染

1.3.1 环境中芳香烃的来源及来源分析

1.3.2 国内外PAHs的污染现状

1.3.3 极地地区持久性污染物的现状

1.4 芳香烃的微生物降解

1.4.1 芳香烃的微生物降解

1.4.2 芳香烃的微生物降解途径

1.4.3 萘的生物降解途径

1.4.4 菲的生物降解途径

1.4.5 微生物降解多环芳烃混合物

1.4.6 影响多环芳烃微生物降解的因子

1.5 芳香烃化合物的降解基因研究

1.5.1 PCBs降解基因bph的结构和组成

1.5.2 菲的降解phd基因操纵子

1.6 低温微生物在海洋污染的生物修复中的作用

1.6.1 低温微生物的分布

1.6.2 芳香烃的低温微生物降解

1.7 南极低温芳香烃降解菌的拉曼光谱研究

1.8 本研究的创新及意义

2 南极海洋低温芳香烃降解菌株的筛选

2.1 材料和方法

2.1.1 细菌样品

2.1.2 试剂与仪器

2.1.3 培养基

2.1.4 试验方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 南极低温萘降解菌的筛选结果

2.2.210 ℃条件下低温降解菌的CFU计数

2.2.3 南极低温芳香烃降解菌的生长曲线的测定

2.2.4 萘的标准工作曲线

2.2.5 低温降解菌降解萘的能力的测定

2.3 本章小结

3 环境因子对南极低温降解菌降解萘的影响

3.1 材料和方法

3.1.1 材料

3.1.2 仪器和药品

3.1.3 生物摇床实验

3.1.4 分析方法

3.1.5 不同影响因子对降解的影响

3.2 结果与讨论

3.2.1 温度对南极低温细菌NJ41、NJ49 和NJ289 的生长及萘降解的影响

3.2.2 培养基初始pH值对南极低温细菌NJ41 的生长及萘降解的影响

3.2.3 萘的初始浓度对南极低温细菌NJ41 的生长及萘降解的影响

3.2.4 不同氮源对南极低温细菌NJ41 的生长及萘降解的影响

3.2.5 不同转速对南极低温细菌NJ41 的生长及萘降解的影响

3.2.6 微量元素对南极低温菌NJ41 的生长及萘降解的影响

3.2.7 溶解氧对南极低温细菌NJ41 的生长及萘降解的影响

3.2.8 盐度对南极低温细菌NJ41 的生长以及萘降解的影响

3.3 本章小结

4 南极低温降解菌的降解特性以及混合菌株对芳香烃的降解

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 仪器

4.1.3 试验与方法

4.1.4 南极低温降解菌NJ41 酶学性质的测定

4.2 结果与分析

4.2.1 南极低温降解菌NJ41 对菲的降解

4.2.2 南极低温降解菌混合菌群对萘的降解

4.2.3 南极低温降解菌NJ41 酶学性质的测定

4.3 本章小结

5 南极低温芳香烃降解菌的拉曼光谱研究

5.1 实验装置和方法

5.1.1 实验装置

5.1.2 材料和样品

5.1.3 实验方法

5.1.4 数据处理

5.2 结果与分析

5.2.1 南极细菌NJ41 的拉曼光谱

5.2.2 降解产物培养液的拉曼光谱

5.2.3 南极细菌NJ49 和NJ289 的拉曼光谱

5.3 本章小结

6 结语

参考文献

攻读硕士期间发表文章

致谢