南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341产适冷蛋白酶及低温适应性的研究

摘要

南极具有独特的地理及气候特征，其主要特点是变化极大的光照辐射、季节性的光照时间；常年极低的水温(通常在—1.8℃～2.0℃)，在冬季最低温度可以达到一50℃；高盐度环境(海水中的盐度一般为34‰～35‰)，海冰中的盐囊和盐通道的盐度可达到150‰，因此形成了一个酷寒、强辐射和高盐度的自然环境。为了适应极端的环境，生存于其中的微生物必然具备了相应独特的生理生化和分子机制。因此南极微生物不仅是研究在低温条件下生物适应性的极好材料，而且也是获得在低温条件下具有较大催化能力的适冷酶类的最佳来源。对南极微生物及其产生适冷酶的研究有着重要的生物学意义；同时，由于适冷酶能在低温下有效发挥催化作用的特点，在生物工程领域有着广阔的应用前景。本研究以南极海冰嗜冷菌Colwellia sp.NJ341为研究对象，对该菌株分泌的胞外适冷丝氨酸蛋白酶进行系统的研究，同时对该菌株的低温适应性也予以初步探讨，以期为南极微生物的深入研究和开发应用提供科学依据。 (1)采用水解酪蛋白平板法对本试验室保存的260株南极低温微生物产适冷蛋白酶情况进行测定，发现107株具有蛋白酶活性，其中5株菌(NJ276、NJ341、NJl6-70、NJ345、NJ5-9)所产的蛋白酶活性高于45 U/ml。除NJ5-9菌株外，对其余4株菌所产蛋白酶的部分酶学特性进行研究，发现蛋白酶的酶学性质及酶的种类和数量在种间存在差异。菌株NJ276、NJl6-70分泌的蛋白酶接近中温蛋白酶，NJ34l、NJ345分泌的蛋白酶属于适冷蛋白酶。随后，对5株菌进行了16S rRNA分子鉴定，菌株 NJ276、NJ5-9、NJl6．70、NJ345均属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp．)；菌株NJ341属于科尔韦尔氏属(Colwellia sp．)。 (2)以国内外研究较少且只分泌一种适冷蛋白酶的嗜冷菌Colwellia sp．NJ341作为研究材料，进行酶的优化培养、分离纯化及酶学性质的研究。结果表明，菌株 NJ341发酵培养基的初始pH和通气量的最适值，分别为pH7～9和50～120ml/250 ml摇瓶；6％NaCl盐度对菌体的生长和产酶最有利；酪蛋白和柠檬酸钠分别为培养基中最佳氮源和碳源；K<'+>和吐温-80有利于产酶；氨基酸对产酶的影响较小。在单因素基础上，首次将响应面分析法(RSM)应用到低温发酵培养中，模拟出产蛋白酶的二次多元回归模型，确定了最优的发酵条件为：酪蛋白，5g/l；柠檬酸钠，3.75g/l；吐温-80，0.2g/l；酵母提取物，1g/l；NaCl，10g/1；陈海水，1000 ml；初始pH，7.5；温度，8℃；200 rpm振荡培养96h。通过验证试验发现，产蛋白酶模型有较好拟合性，产酶量达到175U/ml，产酶稳定性好。这些数据将为该酶的大规模发酵生产提供重要参数。 (3)通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A50离子交换层析、Sephadex G-75 凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析四个主要分离步骤后，嗜冷菌Cohwellia sp.NJ341适冷蛋白酶纯化物总蛋白为0.4 mg；酶的总纯化倍数达31.3倍；总回收率为8.9％；比活力提高到13826.0U/mg；考马斯亮兰染色、银染 和酶谱电泳鉴定均为单一带，表明该蛋白酶达到了均一性。进一步通过HPLc对 纯化后蛋白酶样品纯度进行鉴定，呈单一主峰，纯度为91.8％，达到色谱纯纯度。利用MALDI-TOF-MS质谱测定其分子量为59.816 KDa。 (4)在获得较高酶纯度的基础上，首次对南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341所产胞外适冷丝氨酸酶酶学性质进行系统的研究。结果表明，该菌株主要分泌一种胞外适冷蛋白酶，其最适温度为35℃；它对高温具有不稳定性，50℃处理30min或60℃处理10 min能彻底灭活；-78℃和-20℃保藏是最佳的保藏方法。在pH5～12时蛋白酶都有活力，pH9时酶活力最高；在最适pH范围之内，酶是稳定的。丝氨酸蛋白酶抑制剂(PSFM)对该酶抑制作用最强；金属蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA、金属离子和变性剂均有一定的抑制作用；而半胱氨酸蛋白酶抑制剂E164对蛋白酶活力没有影响；表面活性剂对酶活力影响小。在不同温度条件下，K<,m>变化幅度不大，在温度为35℃达到最大值；随着温度升高，K<,cat>和K<,cat>/K<,m>一直增加，其最大值出现在40℃，分别是0℃时的2.9和2.1倍；蛋白酶的活化能为36.7kJ/mol。4℃下该酶对牛奶蛋白的酶解效果好于中温木瓜蛋白酶的，产生游离氨基酸的总量是木瓜蛋白酶水解的1.61倍，是未加蛋白酶水解的35.3倍。值得注意的是，该酶在0～10℃保持30％的相对活力；在0～2M Nacl浓度下酶的活力保持不变；氧化剂H<,2>O<,2>对酶活力影响小，这些性质都有别与其它的适冷蛋白酶，显然与该菌株长期生长在南极海冰自然环境有关。

目录

文摘

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1前言

2南极微生物产低温蛋白酶菌株的筛选

3 5株产蛋白酶南极嗜冷菌的16S rRNA分子鉴定

4南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341产适冷蛋白酶的优化培养

5南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341产适冷蛋白酶的分离纯化

6南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341适冷蛋白酶酶学性质研究

7南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341低温适应性的研究

8结论

参考文献

攻读博士期间发表文章

致谢