虾（Penaeus Vannamei）过敏原免疫活性的研究

摘要

虾是人类最优质动物蛋白的来源之一，也是八大类容易引起过敏的食物之一。随着国际贸易的发展，其在食品中的应用越来越广泛，食用虾引起过敏的潜在危害更值得重视。本论文主要从虾过敏原蛋白的分离纯化、抗体的制备、免疫检测、不同因子对其免疫活性的影响以及虾过敏的诊断等方面进行研究，得到如下结论。 1．不同患者对虾中过敏原蛋白的识别不同，试验共识别到8个条带，其中识别率最高的是分子量为36kD的原肌球蛋白，超过80％的患者血清IgE能够与其反应，其次是分子量在85kD的蛋白，除此之外，52kD、41kD、31kD、30kD、22kD的蛋白也都有识别。对不同品种的虾的免疫识别发现，虽然虾抽提物的蛋白组分稍有差别，但主要过敏原均为分子量为36kD的原肌球蛋白，其免疫活性没有明显的差别。 2．建立了虾过敏原蛋白活性检测的Dot-ELISA技术体系；利用纯化的虾过敏原蛋白作为抗原分别获得鼠源和兔源的效价为160,000和80,000的抗体。在实验中，本论文首次采用S180细胞刺激经过3次加强免疫的小鼠产生腹水，成功的获得了效价为40,000的虾过敏原蛋白抗体，经过纯化后的抗体效价提高2倍以上，且对虾过敏原蛋白具有特异性。 3．以获得的鼠源抗体为一抗，建立了间接竞争酶联免疫检测虾过敏原蛋白的方法，检测限为1.85ng／mL，线性检测范围为4.79-1400ng／mL，板内变异系数为3.4％～9.1％，板间变异系数在12.9％～19.6％，达到了国际同类产品的水平。 4．以鼠源抗体为捕获抗体，胶体金标记的兔源抗体为检测抗体，制备了虾过敏原蛋白检测的免疫渗滤试剂盒，检测限达到250ng／ml，检测时间在15min之内，达到了快速、简便、特异性的要求，但仍需进一步提高灵敏度。 5．本试验首次采用超声波处理虾过敏原蛋白，结果表明，在一定的条件下，超声波能够降低虾过敏原蛋白的免疫活性。在0℃的条件下，超声波处理无论对于虾抽提物还是虾肉都没有明显的影响。但在50℃条件下，超声波处理虾抽提物的IC<,50>值比未经处理的增大了10倍。而超声波处理的虾肉其过敏原蛋白的IC<,50>值更是从0.7gg/mL增加到11μg/mL,这说明在50℃条件下超声波处理能够降低虾过敏原蛋白的免疫活性,是一种有效降低虾过敏原蛋白免疫活性的方法。当然这种结果还需要进一步的临床实验来证实。 6.辐照可以导致虾过敏原蛋白免疫活性的变化,当辐照剂量低于10kGy时,处理的虾抽提物和虾肉的免疫活性有稍微增加;当辐照剂量大于10kGy时,虾过敏原蛋白的免疫活性下降。辐照和加热联合作用可以显著降低虾过敏原蛋白的免疫活性,10kGy辐照后,在沸水中加热5min,其IC<,50>值是未经处理的抽提物的20-30倍,延长加热时间不能够继续使其免疫活性有明显的下降。 7.利用羊抗人IgE抗体为捕获抗体,以金标虾过敏原蛋白作为检测试剂,建立了诊断虾过敏的免疫渗滤试剂盒,该试剂盒的特异性,重复性好,与商业化的ⅣT702食物过敏检测试剂盒检测结果符合率为87.5[％],仍有待进一步的完善。

目录

文摘

英文文摘

0前言

1虾过敏原蛋白的分离纯化

2虾过敏原蛋白多克隆抗体的制备及纯化

3虾过敏原蛋白的酶联免疫检测

4.斑点免疫金渗滤法检测虾过敏原

5加工处理对虾过敏原免疫活性的影响

6.不同品种甲壳动物过敏原的免疫活性分析

7.虾过敏疾病的诊断

8.结论与建议

参考文献

攻读博士学位期间发表和接受的论文

致谢