盐生杜氏藻培养条件优化、株系筛选和不同株系的rDNA ITS、rbcL序列差异分析

摘要

本论文中我们通过单细胞分离和紫外诱变两种方法来筛选具有优良性状的盐生杜氏藻(Dunaliella salina)株系，以期能获得生长速率快、β-胡萝卜素含量高、具备工业化养殖潜力的株系。而且通过室内和室外实验优化了包括光照、温度和培养基在内的盐生杜氏藻培养条件，为实现工业化养殖的在线调控提供了实验和理论基础。另外，克隆得到4株筛选株系(D.salina BJ38、OUC21、OUC36和OUC66)、2株养殖用株系(D.salina Inner-mongolia和D.salina Israel)、普林莫杜氏藻(D.primolecta)和一株未定种(D.sp.hd10)在内的8株杜氏藻株系的核糖体转录间隔区序列(rDNA ITS)和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶／氧化酶大亚基基因(rbcL)部分序列，基于这两段序列对8株杜氏藻株系进行了分子系统学和基因型差异分析。 单细胞分离法筛选得到2株盐生杜氏藻株系(BJ8和BJ38)，通过2次正交实验研究了光照、温度和营养盐对盐生杜氏藻生长和β-胡萝卜素积累的影响，旨在探明适于盐生杜氏藻生长和β-胡萝卜素积累的光照、温度和营养盐条件，并对实验中2株筛选株系与出发株(D.salina BJ)的生长和β-胡萝卜素积累速率进行了初步的比较。结果表明，盐生杜氏藻生长的最适光照和温度分别是145.3μmol·m<'-2>和23℃，适于β-胡萝卜素积累的光照和温度分别是218.2 μmol·m<'-2>·s<'-1>和23℃；适于生长的营养盐条件是NaNO<,3>3 0.4mmo／L、尿素0.6mmol／L、NaHCO<,3> 18mmol/L，而当NaNO<,3>、尿素、NaHCO<,3>浓度分别为O、0.2、18 mmol／L时有利于β-胡萝卜素的积累。高光照、低温有利于杜氏藻细胞β-胡萝卜素的积累，在218.2μmol·m<'-2>·s<'-1>光强培养的3组和15℃下培养的3组其细胞β-胡萝卜素积累平均值可分别达10.39pg／cell、12.46pg／cell。3个株系中BJ38积累β-胡萝卜素的能力高于另外两株，但差异不显著。 以单细胞分离筛选得到的盐生杜氏藻株系BJ38为出发株，利用紫外诱变筛选得到3株盐生杜氏藻株系(OUC2l、OUC36和OUC66)，研究了所选择的3株诱变株对光照和温度的反应。结果显示，光照实验中诱变株和出发株(BJ38)生长与β-胡萝卜素积累的最适光照强度相同，都是214.08μmol m<'-2>s<'-1>，此光强下诱变株的生长速率要高于出发株，其中OUC36生长速率最快，藻细胞密度(86.6×10<'4>／mL)比出发株(69.1×10<'4>／mL)高25％；3株诱变株中只有OUC36单位体积藻液β-胡萝卜素的积累量(10.76mg/L)高于出发株(10.10mg／L)，而OUC2l(6.68mg/L)则低于出发株，各光强下3株诱变株单位体积藻液叶绿素的积累量都高于出发株。诱变株与出发株在最适生长温度上表现出差异性，出发株生长的最适温度为22℃，诱变株OUC66与之相同，而OUC21和OUC36生长的最适温度是28℃，实验中同一温度条件下诱变株的生长速率高于出发株，最大的也是OIJC36；适于B一胡萝卜素积累的温度，诱变株与出发株相同，都是22℃，3株诱变株中同样是OUC36单位体积藻液β-胡萝卜素积累量(7.9mg/L)最大，略高于BJ38(7．84mg／L)，而OUC2l(5.31mg／L)最低，各温度下诱变株单位体积藻液叶绿素含量高于出发株。OUC36具有生长速率快和积累β-胡萝卜素能力强的优点，可能成为适用于大规模养殖的藻种。在无棣，将诱变株OUC36进行室外养殖以验证其养殖潜力。采用基于兰太卤水优化的培养基，使用埕口卤水培养，初始接种生物量为4．959×10<'lO>cells，14天后生物量达到4．628×10<'11>cells，增长率高达8.33，细胞平均生长速率为16.0％d<'-1>，显示了室外养殖OUC36仍具有较高的生长速率，也初步说明优化的培养基适用于埕口卤水。 在内蒙古兰太生物工程公司养殖基地工作期间，主要通过室外1m<,2>PVC扩种池探讨了工业化养殖中的N源及添加量，并通过正交实验优化了养殖用培养基。结果表明：室外养殖时0.2mmo1／L的NH4N03即对细胞造成伤害；营养盐正交实验结果显示盐生杜氏藻生长的最适浓度为NaNO<,3>-0.4mmol／L，尿素-0.6mmol/L和NaHCO<,3>一12mmol／L。 对8株杜氏藻株系的rDNA ITS序列和rbcL基因序列分析结果显示：在种间水平上，rDNA ITS序列存在更多的多态性位点(polymorphic sites，52)和信息位点(parsimony informative sites，49)，而在6株盐生杜氏藻株系相互之间，rbcL基因序列中存在更多的碱基替代(2-6个)。在以小杜氏藻(D．parva)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtiL)和小球藻(Chlorella vulgar&)为外类群，利用Mega2．1软件基于两段序列使用邻位相连法(neighborjoining，NJ)和最大简约性法(maximum parimony，MP)两种方法构建的分子系统树拓扑结构类似，盐生杜氏藻(D.salina)所有株系聚为一单系群，得到98—100％的靴带支持率，而普林莫杜氏藻和D.sp.hdlO聚为一簇，靴带支持率高达98-100％。与出发株BJ38相比，3株紫外诱变株系显示出不同的遗传性变异，但碱基替代多发生在胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)之间。另外，基于8株杜氏藻的表型分析支持分子系统学分析结果。

目录

文摘

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前言

第一章光照、温度和营养盐对3株盐生杜氏藻生长和色素积累的影响

第二章紫外诱变及具有优良性状的盐生杜氏藻藻株的筛选

第三章盐生杜氏藻工业化养殖的在线调控

第四章基于rDNA ITS和rbcL基因序列对8株杜氏藻的系统学和基因型差异分析

参考文献

附录

文章发表情况

致谢