钝顶螺旋藻/节旋藻藻蓝蛋白的提取纯化及抗肿瘤免疫效应研究

摘要

从海洋生物中寻找高效、低毒副作用的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的新领域。近年来，随着海洋生物药学研究的不断深入，发现许多海洋生物尤其许多藻类，其体内含有各种特有药物功能。其中钝顶螺旋藻(Spirulina ptatensis,又称钝顶节旋藻Arthrospira platensis)中的藻蓝蛋白(C-phycocyanin，CPC)以其特有的营养和保健价值受到广泛的重视。因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点，CPC被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。带有荧光，可用作荧光标记物。另有研究表明藻蓝蛋白具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、清除自由基和保肝、降血脂等生理活性，这为螺旋藻在功能性食品和药品领域的开发提供重要的决策依据。目前有关藻蓝蛋白抗肿瘤免疫机理的研究国内外报道较少，本课题研究的主要目的旨在揭示藻蓝蛋白发挥作用的深层机理，以期更深层次的发挥其应用价值。 首先对钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的提取和纯化方法进行了改进。采用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超生波破碎法，50％硫酸铵沉淀获得CPC，提取率达到13.1％。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱(HA)层析和sephacrylS-200HR凝胶层析对其进行纯化，纯度达到4.71％。纯化后的CPC在12％SDS-PAGE中得到两条带，分别是α和β两个亚基，分子量分别为21.4ku和17.0ku。结果表明，通过上述分离纯化过程得到了较高提取率和电泳纯度的CPC。 然后我们对CPC的抗肿瘤免疫活性进行了研究。主要包括5个方面：①cpc的体外抑瘤作用研究：检测CPC对人宫颈癌细胞(HeLa)、乳腺癌细胞(MCF)、胃癌细胞(NKM)、卵巢癌细胞(SVOA)、人胚肺细胞(HEL)体外生长的影响。在体外培养条件下用不同浓度的CPC(终浓度为20，40，80，160μg/ml)处理这4种癌细胞和1株正常细胞，运用MTT法检测CPC对细胞生长的影响。结果显不CPC对这4种癌细胞均有不同程度的抑制作用，并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强，但对正常细胞无明显影响。②CPC诱导HeLa细胞凋亡的分子免疫机理探讨：通过流式细胞仪检测CPC对HeLa细胞的细胞周期变化的影响，结果发现出现一个亚二倍体峰(GO-Gl)；电镜检测细胞的凋亡形态；琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA结构变化，结果显示DNA发生片段化，呈现梯状；免疫组织化学法检测CPC对细胞表面凋亡相关蛋白(Fas、ICAM-1、Bc1-2)表达的影响,结果表明CPC可促进促凋亡基因Fas、ICAM-1的表达同时抑制抗凋亡基因Bc1-2的表达;检测还发现凋亡细胞的caspase酶的活性增强且细胞内细胞色素c由线粒体向胞浆的释放。通过上述试验检测CPC对HeLa细胞凋亡信号转导通路的影响,从而揭示了CPC诱导HeLa细胞凋亡的作用机理。③CPC的体内抗肿瘤免疫活性研究:建立S180荷瘤小鼠动物模型,腹腔注射CPC,11天后通过QHS、ELISA、MTT等试验从免疫器官、免疫细胞、免疫分子水平上检测CPC的抗肿瘤免疫效应。结果显示,CPC组小鼠瘤块直径及瘤体重量均小于对照组,T细胞及B细胞活性明显增强,体液抗体量显著提高,CPC高剂量组比低剂量组抑制肿瘤细胞生长和提高机体免疫力的作用更明显。从而揭示藻蓝蛋白的抗肿瘤作用与机体免疫系统免疫功能的增强有关。④探讨CPC对HeLa细胞CD59基因表达的调控作用。以正常人CD59cDNA为模板,经PCR扩增后重组入真核表达质粒载体pALTER-MAX,然后利用阳离子脂质体(Lipfectamine-2000)将重组质粒和PeDNA共转染HeLa和对照用正常中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)进行表达。用不同浓度的CPC作用于转染细胞,通过核酸分子杂交技术、免疫荧光标记法和ELISA法对细胞中CD59分子的表达进行检测。结果表明:成功构建了重组质粒pALTER-MAX-CD59,并将其导入真核细胞(HeLa,CHO),经G418筛选获得了CD59分子高效表达的细胞克隆。用CPC作用于筛选出的转基因细胞,证实CPC可促进HeLa细胞表面CD59蛋白和Fas蛋白的表达、并抑制HeLa细胞的增殖,而对于正常CHO细胞无明显作用,从而提示CD59可能参与CPC的抑癌作用。⑤CPC介导的光动力学疗法用于宫颈癌的治疗:本研究是通过建立HeLa荷瘤小鼠动物模型,脾区注射藻蓝蛋白后,经He-Ne激光辐照瘤体13天后,取胸腺、脾脏检测NK细胞活性并采用MTT法检测免疫细胞增殖活性。取瘤块制成石蜡包埋切片,采用免疫组织化学技术检测组织细胞内P53、NFκB、Fas、CD44基因的表达,以期判定藻蓝蛋白是否具有光敏作用及可否作为光敏剂用于肿瘤的激光治疗,并对藻蓝蛋白对癌激光治疗增敏作用的机理进行探讨。结果表明,与仅照射激光组和对照组相比,NK细胞和免疫细胞的增殖活性明显增强,肿瘤细胞内抗癌基因(Fas)表达量显著增多而抗凋亡基因(P53、NFκB、CD44)明显减少,这证实藻蓝蛋白的确具有光敏作用,是一种理想的光敏剂。

目录

文摘

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第一章文献综述和立项依据

第二章钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取和纯化

第三章钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的体外抑瘤作用研究

第四章钝顶螺旋藻藻蓝蛋白对HeLa细胞凋亡信号传导作用的研究

第五章钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的体内抗肿瘤免疫效应研究

第六章钝顶螺旋藻藻蓝蛋白对HeLa细胞CD59基因表达调控作用的研究

第七章钝顶螺旋藻藻蓝蛋白介导的光动力学疗法用于治疗宫颈癌的研究

总结

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