几种免疫促进剂对菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）酚氧化酶的产量和活性以及血细胞的数量和超微结构的影响

摘要

许多免疫促进剂均能不同程度地增强无脊椎动物的自身免疫力，研究其对水产养殖贝类免疫系统的影响及其作用机制，对贝类免疫学具有重要的理论意义；而筛选出高效的免疫促进剂，对提高养殖贝类的自身免疫力、降低其死亡率、进而提高养殖效益，还具有十分重要的应用价值。目前已有采用免疫促进剂提高中国对虾自身免疫力的相关细胞和分子作用机理的研究报道，但在菲律宾蛤仔中尚未见有研究报道。 本文以菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)的血淋巴为材料，采用脂多糖(LPS)、β-葡聚糖(β-1，3-glucan)、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌四种免疫促进剂对菲律宾蛤仔进行了免疫刺激，利用离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析对酚氧化酶(phenoloxidase，PO)进行了分离纯化，并以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)作为特异性底物对其酶活性进行了测定，对上述免疫促进剂对菲律宾蛤仔PO产量及活性的影响进行了研究。 对经LPS、β-葡聚糖、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌刺激前后菲律宾蛤仔血淋巴中酚氧化酶纯化样品的蛋白浓度及酶活性的研究结果显示，经上述四种免疫促进剂刺激后菲律宾蛤仔酚氧化酶的产量分别提高了103.45％、65.52％、17.24％和27.59％，总酶活性分别提高了105.9％、64.7％、17.65％和29.41％，单位酶活性几乎没有变化。表明四种免疫促进剂均能不同程度促进菲律宾蛤仔酚氧化酶总酶活性提高，且这种促进作用是通过提高酚氧化酶产量来完成的。四种免疫促进剂中β-葡聚糖对菲律宾蛤仔酚氧化酶的产量和总酶活性促进作用最大。 以菲律宾蛤(Ruditapes philippinarum)的血淋巴为材料，采用脂多糖(LPS)、β-葡聚糖(β-1，3-glucan)、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌四种免疫促进剂对菲律宾蛤仔进行了免疫刺激，利用血细胞计数、透射电镜观察对刺激前后菲律宾蛤仔血细胞的数量、超微结构进行了系统研究。血细胞计数结果表明，经上述四种免疫促进剂刺激后的菲律宾蛤仔总血细胞数量分别增加了42.7％、39.56％、42.0％和83.0％；小颗粒细胞数量分别增加了49.49％、41.08％、44.78％和69.02％，说明四种免疫促进剂均能不同程度促进菲律宾蛤仔血细胞的增殖，且血细胞数量的增加主要是通过小颗粒细胞数量的增加实现的。四种免疫促进剂中灭活鳗弧菌对增加菲律宾蛤仔总血细胞数量和小颗粒细胞数量的能力最强。对LPS和β-葡聚糖刺激前后菲律宾蛤仔血细胞透射电镜结果的观察，发现菲律宾蛤仔血细胞的超微结构在免疫刺激后也发生了变化，三种血细胞的糙面内质网、核糖体和线粒体的数量均有一定程度的增加，其中以小颗粒细胞和大颗粒细胞的超微结构变化幅度最大。经灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌刺激后，菲律宾蛤仔小颗粒细胞超微结构变化幅度较大，但大颗粒细胞超微结构变化不明显。说明LPS和β-葡聚糖主要通过增加血细胞数量、proPO激活系统组分蛋白的产量来增强菲律宾蛤仔免疫力，而灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌则通过增加大颗粒细胞及小颗粒细胞的数量，进而增加PO产量和血细胞的吞噬能力。 综合研究结果可得出如下结论：以上四种免疫促进剂之所以能够增强菲律宾蛤仔自身免疫力，是通过刺激血细胞(主要为小颗粒细胞)数量增多、改变血细胞超微结构，进而增加酚氧化酶产量，最终提高酚氧化酶的总酶活性来实现的。这是首次在国际上提出了LPS、β-葡聚糖、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌对提高菲律宾蛤仔免疫力的细胞和分子作用机理，不仅对揭示贝类等无脊椎动物非特异性免疫机理具有重要的理论意义，而且为四种免疫促进剂应用于贝类养殖业，增强养殖贝类免疫力，提供一定的理论基础和科学依据，对提高贝类贝类养殖经济效益具有重要的指导意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

1无脊椎动物的非特异性免疫系统

1.1细胞免疫

1.2体液免疫

2水产动物免疫促进剂

2.1水产动物免疫促进剂的种类

2.2免疫促进剂的生物学功能及其作用机理

2.3影响免疫促进剂作用效果的因素

3本文研究的目的及意义

1几种免疫促进剂对菲律宾蛤仔酚氧化酶活性和产量的影响

1.1材料与用品

1.1.1实验材料

1.1.2实验仪器

1.1.3实验药品

1.1.4几种常用溶液配方

1.2方法

1.2.1菲律宾蛤仔酚氧化酶分离提纯方法的建立

1.2.2灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌悬液的制备

1.2.3四种免疫促进剂处理菲律宾蛤仔的方法

1.2.4四种免疫促进剂处理后菲律宾蛤仔酚氧化酶样品的制备

1.3结果

1.3.1 SDS-PAGE电泳

1.3.2四种免疫促进剂对菲律宾蛤仔PO产量的影响

1.3.3四种免疫促进剂对菲律宾蛤仔PO活性的影响

1.4讨论

1.5结论

2.1材料与用品

2.1.1实验材料

2.1.2实验仪器

2.1.3实验药品

2.2方法

2.2.1灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌悬液的制备

2.2.2四种免疫促进剂处理菲律宾蛤仔的方法

2.2.3菲律宾蛤仔血细胞的获得

2.2.4血细胞透射电镜样品的制备

2.3结果

2.3.1对照组菲律宾蛤仔血细胞超微结构和不同种血细胞的比例

2.3.2四种免疫促进剂对菲律宾蛤仔血细胞的数量的影响

2.3.3四种免疫促进剂对菲律宾蛤仔血细胞超微结构的影响

2.4讨论

2.5结论

全文总结

参考文献

附录

已发表论文及发明专利

致谢