米根霉和鼠李糖乳杆菌乳酸发酵工艺的研究

摘要

乳酸是食品、医药、化工等工业领域中广泛应用的一种重要有机酸，随着聚乳酸作为生物可降解塑料的迅速发展，国内外对高光学纯度的L-乳酸需求也来越大，其市场潜力巨大。 目前世界乳酸生产大部分采用发酵法生产，而应用发酵法生产乳酸常用的微生物仅有两大类，一类为细菌，多采用乳酸菌(Lactic acid bacteria)；另一类为霉菌，多采用根霉(Rhizopus)。根霉是好氧真菌，产L-乳酸光学纯度高，营养要求简单，只需要无机氮源及少量其它无机盐，而且有分泌淀粉酶的能力，可以直接以淀粉为碳源，理论转化率为75％。乳酸菌可以在兼性厌氧条件下发酵，属于化能异养型微生物，不能直接利用淀粉，它们缺乏对许多有机化合物的合成能力，必须由外界提供多种营养物质和生长因子，乳酸发酵的理论转化率可达100％。，考虑到根霉和乳酸菌乳酸发酵的以上特点，本论文提出了根霉(米根霉)与乳酸菌(鼠李糖乳杆菌)的共固定化微胶囊直接利用淀粉发酵生产L-乳酸的新工艺。鼠李糖乳杆菌固定在微胶囊内部，米根霉固定在微胶囊外层。在有氧条件下，固定在微胶囊外层的米根霉利用自身分泌的淀粉酶将淀粉糖化并进行耗氧发酵，部分糖传递进入微胶囊内部供鼠李糖乳杆菌进行厌氧发酵，过程既具有同时糖化同时发酵(SSF)的特点，又实现双菌叠加发酵。该工艺的实现有可能解决固定化米根霉L-乳酸发酵过程中载体利用率低、生产率低、转化率不高的难题，进一步降低L-乳酸的生产成本，推动固定化发酵生产L-乳酸的工业化，因此具有较好的工业应用价值。 本文以米根霉(Rhizopus oryzae)AS3.819和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)1.549为对象，分别进行了L-乳酸悬浮发酵工艺的优化和发酵动力学研究，并对共固定化米根霉和鼠李糖乳杆菌协同发酵淀粉生产L-乳酸的工艺进行了初步探索。 首先，对米根霉AS3.819摇瓶悬浮培养发酵生产L-乳酸的工艺进行了研究，确定了摇瓶发酵最佳培养条件为34℃，摇床转速为160转/分，种子培养18小时后接入发酵培养基，接种量为10％，并通过正交实验确定了摇瓶最佳发酵培养基为：葡萄糖80g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 0.3 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，MgSO4 0.3 g/L。在最适发酵工艺条件下，该菌株的摇瓶悬浮培养发酵L-乳酸浓度稳定在61.5g/L左右，对糖转化率可达76.9％。 第二，建立了米根霉AS3.819以葡萄糖为碳源发酵生产L-乳酸的动力学模型，并在摇瓶优化发酵培养基的基础上确定了动力学模型参数。结果表明所建立的模型较好地反映了米根霉的乳酸发酵机制。产物乳酸的生成是以生长机制为主的混合动力学机制。利用上述动力学模型和参数对培养基中初始葡萄糖浓度分别为72g/L和74g/L的发酵过程进行预报，实验结果与模型预报值有良好的一致性。 第三，研究了鼠李糖乳杆菌1.549摇瓶悬浮培养发酵L-乳酸工艺，确定了摇瓶发酵最佳培养条件为34℃，种子培养8小时后接入发酵培养基，接种量为5％。通过正交实验确定了摇瓶最佳发酵培养基为：酪蛋白胨15g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖50g/L，柠檬酸二铵1g/L，K2HPO4 2g/L，乙酸钠2g/L，MgSO4 0.3g/L，MnSO4·H2O 0.03g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L。在最适发酵工艺条件下，该菌株的摇瓶发酵产L-乳酸浓度稳定在45g/L左右，对糖转化率最高可达90％。 第四，研究了鼠李糖乳杆菌利用葡萄糖的乳酸发酵动力学，建立了发酵动力学模型，模型考虑了初始葡萄糖浓度和产物乳酸的积累对发酵过程的影响。考察不同初始葡萄糖浓度对动力学模型的影响。模型结果与实验结果吻合良好。鼠李糖乳杆菌的乳酸发酵机制属于部分生长耦联型。动力学参数揭示高浓度的初始葡萄糖底物和乳酸产物的积累对发酵的影响主要的是由于其对细胞生长的抑制。 最后，对米根霉和鼠李糖乳杆菌共固定化微胶囊发酵生产L-乳酸进行了初步研究，确定了最佳发酵培养基为：淀粉60g/L，酵母膏6g/L，KH2PO4 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.02g/L，MgSO4 0.4g/L；固定化条件为：海藻酸钠浓度1％，米根霉孢子液与鼠李糖乳杆菌悬液体积比为1.5；共固定化细胞增殖培养21小时后，按10％接种量接入发酵培养基。无论双菌共固定化，还是米根霉悬浮+鼠李糖乳杆菌固定化微胶囊的混合发酵，都比单一米根霉发酵，速率上有较明显增加，呈现出了一定的叠加效应。共固定化微胶囊多批次发酵表明微胶囊有较好的发酵稳定性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1乳酸概况

1.1.1乳酸的分子结构

1.1.2乳酸的理化性质

1.1.3乳酸的应用

1.1.4乳酸的生产方法

1.2乳酸发酵的研究进展

1.2.1菌种选育

1.2.2发酵工艺

1.2.3固定化细胞技术

1.2.4发酵动力学

1.3本课题研究的意义及内容

1.3.1研究意义

1.3.2研究内容

第二章米根霉摇瓶发酵乳酸工艺条件的优化

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1实验试剂和仪器设备

2.2.2菌种

2.2.3培养基

2.2.4培养方法

2.2.5分析方法

2.3结果与讨论

2.3.1种龄对发酵的影响

2.3.2接种量对发酵的影响

2.3.3温度对发酵的影响

2.3.4摇床转速对发酵的影响

2.3.5发酵培养基中各种成分对发酵的影响

2.3.6悬浮发酵过程曲线

2.4小结

第三章米根霉摇瓶发酵乳酸动力学

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1菌种

3.2.2培养基

3.2.3培养方法

3.2.4分析方法

3.3结果与分析

3.3.1发酵动力学模型的建立

3.3.2动力学模型比较及参数估计

3.3.3动力学模型的验证

3.4小结

第四章鼠李糖乳杆菌摇瓶发酵乳酸工艺条件的优化

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1菌种

4.2.2培养基

4.2.3培养方法

4.2.4分析方法

4.3结果与讨论

4.3.1种龄对发酵的影响

4.3.2接种量对发酵的影响

4.3.3温度对发酵的影响

4.3.4发酵培养基中各种成分对发酵的影响

4.3.5悬浮发酵过程曲线

4.4小结

第五章鼠李糖乳杆菌摇瓶发酵乳酸动力学

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1菌种

5.2.2培养基

5.2.3培养方法

5.2.4分析方法

5.3结果与分析

5.3.1发酵动力学模型的建立

5.3.2模型比较及动力学参数估算

5.4小结

第六章米根霉鼠李糖乳杆菌共固定化乳酸发酵工艺的研究

6.1引言

6.2材料与方法

6.2.1菌种

6.2.2培养基

6.2.3培养方法

6.2.4分析方法

6.3结果与讨论

6.3.1海藻酸钠浓度对共固定化发酵的影响

6.3.2共固定化体系中米根霉孢子与鼠李糖乳杆菌比例对发酵的影响

6.3.3共固定化微胶囊增殖时间对发酵的影响

6.3.4共固定化微胶囊接种量对发酵的影响

6.3.5共固定化微胶囊与其他发酵方式的比较

6.3.6最佳发酵培养基的确定

6.3.7共固定化微胶囊的稳定性实验

6.4小结

第七章结论

参考文献

致谢

个人简历、发表的学术论文