金鱼（Carassius auratus）卵黄原蛋白mRNA特性及其在环境雌激素筛选中的应用

摘要

卵黄原蛋白(Vitellogenin，VTG)是检测水环境雌激素的重要生物标志物。雄性鱼类VTG mRNA是一种检测环境雌激素的新兴生物标志物。我国水环境生物监测主要采用传统的群落学方法和生物化学检测，应用分子生物学方法检测水环境雌激素的报道较少。久效磷(Monocrotophos，MCP)是一种常用的有机磷农药，已经在我国造成了严重的农药残留污染。本文选用在我国广泛分布的鱼类——金鱼作为模式生物，研究久效磷对雄性金鱼VTG mRNA表达的影响。 实验室邴欣等已成功分离纯化17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)暴露的雄性金鱼血清VTG：用非变性聚丙烯酰胺电泳(PAGE)测得VTG的分子量约为440kDa；用Western-blot技术证明在0.01 mg·L-1、0.10 mg·L-1、1.00mg·L-1三个久效磷浓度暴露组都能够诱导雄性金鱼分泌VTG。基于实验室已经完成的工作，本文采用RT-PCR检测金鱼VTG mRNA的表达，克隆编码金鱼VTG蛋白的部分cDNA片段，并以此为模板制备地高辛标记的RNA探针，用这种分子生物学技术检测环境雌激素对金鱼的雌激素效应，建立了新的筛选环境雌激素的分子生物学方法。 实验所用金鱼购自青岛南山花鸟市场，驯养两周后开始实验。取雌鱼肝脏提取总RNA，根据已知氨基酸序列的鱼种设计兼并引物，RT-PCR扩增金鱼VTG基因片段，得到一条1135bp的特异性条带。将所得DNA进行测序，其序列用NCBI的Blast进行比对。结果显示，扩增所得片段与鲤鱼(Cyprinus carpio)的同源性为94％，与金鱼(Carassius auratus)同源性为93％，与鲦鱼(Pimephales promelas)同源性为90％，并且在系统发生树中与金鱼最为接近，由此可以初步认为这段序列是编码金鱼VTG的基因序列。 为了进一步验证这段序列就是编码金鱼VTG的基因序列，同时建立检测环境雌激素的新方法，将所得片段转入大肠杆菌进行增殖，提取质粒，内切酶SphI将质粒线性化，纯化得到高纯的线性DNA。选取Sp6 RNA聚合酶，以DNA为模板合成DIG标记的cRNA探针。用所得探针(615bp)进行Northern杂交实验，结果显示，0.01 mg L-1、0.10 mg L-1和1.00 mg L-1三个久效磷浓度组表达了与每条鱼0.2μg的17-β雌二醇暴露的金鱼相同大小的VTG mRNA。证明鱼类在久效磷诱导下能够产生与内源雌激素刺激下相同的VTG基因，进一步验证了久效磷是一种环境雌激素。本实验建立了RT-PCR与Northern杂交相结合的以VTG mRNA为生物标志物的筛选环境雌激素的分子生物学方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

1环境雌激素诱导鱼类卵黄原蛋白产生及其机制研究进展

1.1卵黄原蛋白概述

1.2诱导鱼类产生VTG的环境雌激素

1.3以VTG为生物标志物的环境雌激素筛选方法

1.3.1生化检测法

1.3.2细胞培养

1.3.3分子生物学检测法

1.4环境雌激素诱导VTG产生与结构的相关性

1.4.1烷基酚类化合物

1.4.2植物雌激素

1.4.3合成雌激素

1.4.4多氯联苯类化合物

1.4.5邻苯二甲酸酯类化合物

1.5 VTG产生及其诱导机制

1.5.1直接与雌激素受体结合的诱导机制

1.5.2间接与雌激素受体结合的诱导机制

1.6研究展望

2金鱼卵黄原蛋白mRNA特性研究

2.1材料与方法

2.1.1实验动物

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4样本采集

2.1.5 RNA提取

2.1.6 RNA浓度测定和电泳检测

2.1.7 AMV-RT反应体系

2.1.8引物设计

2.1.9 PCR反应

2.1.10 PCR扩增条带的凝胶回收与测序

2.1.11扩增片段的克隆

2.1.12扩增cDNA序列的特异性检测

2.2结果与分析

2.2.1电泳检测RNA质量

2.2.2金鱼肝脏VTG mRNA特异性序列的克隆

2.2.3金鱼肝脏扩增cDNA片段特异性比对

2.3讨论

3久效磷对雄性金鱼VTG的诱导

3.1材料与方法

3.1.1实验动物

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器

3.1.4久效磷暴露实验

3.1.5取样及样品处理

3.1.6 VTG免疫印迹实验

3.2结果与分析

3.3讨论

4久效磷诱导雄性金鱼VTG mRNA表达的检测

4.1材料与方法

4.1.1实验动物

4.1.2主要试剂

4.1.3主要仪器

4.1.4 MCP和E2暴露实验

4.1.5取样及样品处理

4.1.6久效磷和E2暴露组金鱼肝脏总RNA的提取

4.1.7 Northern-blot检测久效磷暴露金鱼VTG mRNA的表达

4.2结果与分析

4.2.1久效磷及E2暴露组金鱼肝脏总RNA的提取

4.2.2质粒的提取

4.2.3 DNA模板的获得

4.2.4 RNA探针的地高辛标记

4.2.5 Northern blot结果

4.3讨论

5结论

参考文献

致谢

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