单环刺螠纤溶酶的分离纯化及其药效学研究

摘要

血栓栓塞性疾病一直以来严重危害着人类的健康，不仅发病率高，而且死亡率和致残率也很高，它主要危害心、脑，肺等血管系统，造成人死亡或者偏瘫残疾。全世界每年新增1500万血栓性病人，在我国每年约有200多万人死于心脑血管疾病，急需溶栓治疗的病人超过500万。因此，血栓性疾病药物研发已经成为当今全世界医学界研究的重点。 应用溶栓剂进行溶栓治疗是当前治疗血栓性疾病的主要手段。虽然溶栓剂已发展了三代，但仍有诸多的副作用，如特异性降解纤维蛋白能力低，易诱发机体出血等。因此，寻找和开发新型溶栓剂仍是治疗血栓性疾病的重要内容。鉴于海洋生物活性物质自身其独特的优点，海洋生物逐渐成为新药研发的珍贵资源。本实验室经多年研究，从海洋无脊椎动物单环刺螠(Urchis unicinctus)中寻找和分离出了一种新型纤溶酶，命名为单环刺螠纤溶酶(UFE)，并对其酶学性质和药效学活性展开相关研究，现将主要研究结果简述如下： 1.单环刺螠体腔液经分子量8，000Da截留超滤，Sephadex G-75，DEAE-52和Sephacryl S-100柱层析分离，获得酶组分经HPLC分析其纯度为95％，SDS-PAGE电泳图谱呈单一蛋白条带。SDS-PAGE法测其相对分子质量约为26kDa。酶纯化倍数为10.2，回收率为13.9％。 2.对此酶进行相关酶学性质的研究，结果表明UFE的最适反应温度为50℃，最适反应pH为8.0；酶活力在pH6.0-9.0时相对稳定；在20℃-50℃温度范围内，具有良好的热稳定性。Mg2+对酶的活性有促进作用，Cu2+、Fe3+. Ca2+、Zn2+、Fe2+、Ba2+等离子对酶活性均具有一定的抑制作用。以酪蛋白为底物，根据双倒数作图法，求得该酶的米氏常数Km=2.2mg/mL为，最大反应速率Vmax=41.15μg/min·mL。 3.UFE具有直接纤溶活性和激酶活性的双重纤溶能力。以尿激酶标准品为参照，琼脂糖纤维蛋白平板法标定UFE的总活力效价为每mg酶含2477.2个尿激酶活力单位，其中激酶活性为每mg酶含1605.6个尿激酶活力单位，约占酶总活力的64.8％。 4.溶血性实验，皮下出血实验，全身过敏实验证实，该酶具有良好的生物安全性。急性毒性实验验证UFE的半致死剂量LD50为571.36mg/kg，95％的可信限为531.83—623.21mg/kg，无毒性。 5.根据UFE降解纤维蛋白原产物分析，推测其为γ-纤溶酶。 6.体外溶栓实验表明，UFE组3h时血栓溶解率达76.3％，与蚓激酶对照组有显著性差异(p<0.01)，具有直接溶解纤维蛋白的能力。 7. UFE可显著延长APTT，PT，CT和TT值，具有明显的抗凝效应，但其抗凝效应不作用于抑制血小板聚集这一环节。体内颈动脉血栓各指标实验表明，UFE可使ELT时间显著缩短，纤维蛋白降解产物FDP含量增多，D-二聚体反应呈阳性，说明UFE使机体继发性纤溶途径明显增强，提高了机体整体的纤溶活力。 综上所述，UFE具有显著的抗凝活性和纤溶活性，具有重要的临床开发价值，值得深入研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一章 前言

1血栓性疾病概述

1.1血栓疾病类型

1.2血栓的形成机制

1.3凝血与纤溶的基本原理

1.4血栓疾病的治疗

1.5溶栓药剂的应用现状及前景

2单环刺螠的相关研究

2.1单环刺螠分类

2.2形态解剖

2.3营养成分分析

2.4体内活性物质

2.5硫化物耐受机制

2.6未来展望

3立论依据与意义

第二章UFE的分离纯化

2.1前言

2.2材料，试剂和仪器

2.2.1材料

2.2.2试剂

2.2.3主要仪器

2.3实验方法

2.3.1蛋白质浓度测定及标准曲线的制作

2.3.2酶活力的测定

2.3.3粗酶的制备

2.3.4酶的分离纯化

2.3.5酶纯度鉴定及分子量测定

2.4实验结果

2.4.1酶粗品的制备

2.4.2纤溶酶的分离纯化

2.4.3分离纯化小结

2.4.4酶纯度鉴定及分子量的测定

2.5讨论

2.6小结

第三章UFE的酶学性质研究

3.1前言

3.2材料，试剂和仪器

3.2.1材料

3.2.2试剂

3.2.3主要仪器

3.3实验方法

3.3.1 pH值对酶稳定性的影响

3.3.2酶的最适反应pH

3.3.3温度对酶稳定性的影响

3.3.4酶的最适反应温度和时间

3.3.5金属离子对酶活力的影响

3.3.6酶的反应动力学

3.3.7 UFE的总纤酶活力、直接降解蛋白活力和激酶活力测定

3.3.8不等量UFE总纤溶活力的量效关系

3.4实验结果

3.4.1 pH对酶稳定性的影响

3.4.2酶的最适反应pH

3.4.3温度对酶稳定性的影响

3.4.4酶的最适反应温度和时间

3.4.5金属离子对酶活力的影响

3.4.6酶的反应动力学

3.4.7纤溶活力标准曲线制作

3.4.8 UFE的总纤溶活力、直接降解蛋白活力和激酶活力测定

3.4.9不等量UFE总纤溶活力的量效关系

3.5讨论

3.6小结

第四章UFE生物安全性评价

4.1前言

4.2材料，试剂和仪器

4.2.1材料

4.2.2试剂

4.2.3主要仪器

4.3实验方法

4.3.1溶血实验

4.3.2皮下出血实验

4.3.3急性毒性实验

4.3.4全身过敏性实验

4.4实验结果

4.4.1溶血实验

4.4.2皮下出血实验

4.4.3急性毒性实验

4.4.4全身过敏性实验

4.5小结

第五章UFE药效学研究

5.1前言

5.2材料，试剂和仪器

5.2.1材料

5.2.2试剂

5.2.3主要仪器

5.3实验方法

5.3.1体外溶栓实验

5.3.2纤维蛋白原降解机理实验

5.3.3静脉抗凝实验

5.3.4血小板凝集实验

5.3.5动脉血栓实验

5.4实验结果

5.4.1体外溶栓实验

5.4.2纤维蛋白原降解实验

5.4.3静脉抗凝实验

5.4.4血小板凝集实验

5.4.5动脉血栓实验

5.5讨论

5.5小结

总结

参考文献

致 谢

个人简历、发表的学术论文及研究成果